人S-100ELISA試劑盒使用說明書
人S-100ELISA試劑盒僅供研究使用
檢測范圍:78 pg/mL -5000 pg/mL;
實驗原理:本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中S-100水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入S-100抗原、生物素化的抗人S-100抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的S-100呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
預(yù)期應(yīng)用:ELISA法定量測定人血清、血漿、細胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中S-100含量。
人S-100ELISA試劑盒組成及試劑配制:
1.酶聯(lián)板:一塊（96孔）
2.標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為5000 pg/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成5000 pg/mL，2500 pg/mL，1250 pg/mL，625 pg/mL，312.5 pg/mL，156 pg/mL，78 pg/mL其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制。如配制2500 pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml 5000 pg/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3.樣品稀釋液:1×20ml/瓶。
4.檢測稀釋液A:1×10ml/瓶。
5.檢測稀釋液B:1×10ml/瓶。
6.檢測溶液A:1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。
7.檢測溶液B:1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
8.底物溶液:1×10ml/瓶。
9.濃洗滌液:1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10.終止液:1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
標(biāo)本的采集及保存:
1.細胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清，并將標(biāo)本保存于-20℃，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.血清:標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注:標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測。
操作步驟:
各試劑在使用前平衡至室溫。
1.加樣:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，輕輕混勻，酶標(biāo)板加上蓋，37℃反應(yīng)120分鐘。
2.棄去液體，甩干，不用洗滌。
3.每孔加檢測溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘,洗板3次，350ul/每孔，甩干。
4.每孔加檢測溶液B工作液 100ul，37℃,60分鐘,洗板5次，甩干。
5.依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色30分鐘（此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯）。
6.依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時蘭色立轉(zhuǎn)黃色）。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。
注：
1.每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。
2.為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)。
洗板方法:
1.手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
2.自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
計算:以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
特異性:本試劑盒可同時檢測重組或天然的人S-100，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。
注意事項:
1.洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
2.一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
3.請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。
4.如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
5.在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。
6.底物請避光保存。
說明:
1.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。
2.濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
3.中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn)。
4.試劑盒保存:-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。
5.有效期:6個月。
