人游離脂肪酸（FFA）ELISA試劑盒使用說(shuō)明書(shū)
人游離脂肪酸（FFA）ELISA試劑盒僅供體外研究使用、不用于臨床診斷!
檢測(cè)范圍:0.47nmol/ml-30nmol/ml，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)請(qǐng)取用以下濃度值:30nmol/ml，15nmol/ml，7.5nmol/ml，3.75nmol/ml，1.88nmol/ml，0.94nmol/ml，0.47nmol/ml。
zui低檢測(cè)限:0.12nmol/ml
實(shí)驗(yàn)原理:用純化的FFA抗體包被微孔板，制成固相載體，往微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的FFA抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過(guò)*洗滌后用底物（TMB）顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的FFA呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（值），計(jì)算樣品濃度。
預(yù)期應(yīng)用:ELISA法定量測(cè)定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中FFA含量。
人游離脂肪酸（FFA）ELISA試劑盒組成及試劑配制:
1.酶標(biāo)板:一塊（96孔）
2.標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）:2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為30nmol/ml，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗ?不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)謩e配制成30nmol/ml，15nmol/ml，7.5nmol/ml，3.75nmol/ml，1.88nmol/ml，0.94 nmol/ml，0.47 nmol/ml，樣品稀釋液直接作為空白孔0 nmol/ml。如配制15 nmol/ml標(biāo)準(zhǔn)品:取0.5ml（不要少于0.5ml ）30 nmol/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3.樣品稀釋液:1×20ml。
4.檢測(cè)稀釋液A:1×10ml。
5.檢測(cè)稀釋液B:1×10ml。
6.檢測(cè)溶液A:1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測(cè)稀釋液A 1:100稀釋?zhuān)ㄈ?10檢測(cè)溶液A/990 檢測(cè)稀釋液A），充分混勻，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（100/孔），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。
7.檢測(cè)溶液B:1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測(cè)稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測(cè)溶液A。
8.底物溶液:1×10ml/瓶。
9.濃洗滌液:1×30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10.終止液:1×10ml/瓶（2 mol/L H2SO4）。
11.覆膜:5張
12.使用說(shuō)明書(shū):1份
自備物品:
1.酶標(biāo)儀（建議儀器使用前提前預(yù)熱）;
2.微量加液器及吸頭，EP管;
3.蒸餾水或去離子水，濾紙;
標(biāo)本的采集及保存:
1.血清:全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4 過(guò)夜后于1000 g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于1000g離心15分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20或-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.其它生物標(biāo)本：請(qǐng)1000g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20或-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
4.樣本處理:血清或血漿標(biāo)本推薦稀釋100倍，如:稀釋100倍，取10uL血清或血漿加入990uL樣品稀釋液。標(biāo)本使用0.02M 的PBS稀釋?zhuān)≒H=7.0-7.2）。
注:以上標(biāo)本均應(yīng)密封保存，4保存應(yīng)小于1周，-20不應(yīng)超過(guò)1個(gè)月，-80不應(yīng)超過(guò)2個(gè)月；標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
操作步驟:
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫，試劑不能直接在37溶解；試劑或樣品配制時(shí)，均需充分混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測(cè)樣品含量，如樣品濃度過(guò)高時(shí)，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋?zhuān)允瓜♂尯蟮臉悠贩显噭┖械臋z測(cè)范圍，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
1.加樣:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100，注意不要有氣泡，加樣 時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37溫育2小時(shí)。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測(cè)溶液A工作液100（臨用前配制），酶標(biāo)板加上覆膜，37 溫育1小時(shí)。
3.棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
4.每孔加檢測(cè)溶液B工作液（臨用前配制）100 ，加上覆膜，37溫育1小時(shí)。
5.棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟3。
6.每孔加底物溶液90，酶標(biāo)板加上覆膜37 避光顯色（反應(yīng)時(shí)間控制在15-30分鐘，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯時(shí)，即可終止）。
7.每孔加終止溶液50，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。
8.立即用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度（值）。
注：
1.試劑準(zhǔn)備：所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫，使用后請(qǐng)立即按照說(shuō)明書(shū)要求保存試劑。實(shí)驗(yàn)操作中請(qǐng)使用一次性的吸頭，避免交叉污染。
2.加樣:加樣或加試劑時(shí)，*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的“預(yù)溫育”時(shí)間，從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。一次加樣時(shí)間（包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
3.溫育:為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗(yàn)時(shí)將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)；同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。
4.洗滌:洗滌過(guò)程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。
5.試劑配制:Detection A及Detection B在使用前請(qǐng)手甩幾下或少時(shí)離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A工作液、檢測(cè)溶液B工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配制使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請(qǐng)配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取檢測(cè)溶液A時(shí)，一次不要小于10 ），以避免由于不準(zhǔn)確稀 釋而造成濃度誤差；請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A工作液、檢測(cè)溶液B工作液。
6.反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀(guān)察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘），如顏色較深，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過(guò)強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。
7.底物:底物請(qǐng)避光保存，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。
洗板方法:
1.手工洗板方法:將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；根據(jù)需要，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。
2.自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。
特異性:本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的人FFA，且與其它相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。
計(jì)算:各標(biāo)準(zhǔn)品及樣本 值扣除空白孔 值后作圖（七點(diǎn)圖），如設(shè)置復(fù)孔，則 應(yīng)取其平均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)）， 值為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。推薦使用專(zhuān)業(yè)制作曲線(xiàn)軟件進(jìn)行分析，如 curve expert 1.3，根據(jù)樣品 值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程式，將樣品的 值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
說(shuō)明:
1.由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對(duì)所有供貨商提供的所有原料進(jìn)行全面的鑒定與分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。
2.zui終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、實(shí)驗(yàn)者的相關(guān)操作以及當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān)，請(qǐng)務(wù)必準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份。
3.在儲(chǔ)存及溫育過(guò)程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染，因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。
4.試劑盒保存：請(qǐng)收到試劑盒后盡快將標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A和檢測(cè)溶液B保存于-20 ，其余試劑短期保存請(qǐng)置于4 ，長(zhǎng)期保存則置于-20 。開(kāi)封后的酶標(biāo)板要密封加干燥劑后保存于-20 ，避免潮濕。
5.濃洗滌液會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。
6.剛開(kāi)啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。
7.有效期：6個(gè)月。
