微生物發(fā)酵是一個(gè)十分復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，由于生物體的生長(zhǎng)、繁殖、代謝有許多不確定性，并受環(huán)境影響比較大，而微生物細(xì)胞內(nèi)同時(shí)進(jìn)行著成千上萬(wàn)種不同的生化反應(yīng)，各有各的調(diào)控機(jī)制，相互促進(jìn)相互制約，因此，其控制過(guò)程也比較難，只能依據(jù)宏觀現(xiàn)象或借助一些檢測(cè)手段來(lái)推測(cè)微觀變化，而后施行進(jìn)行人為干預(yù)，進(jìn)而引導(dǎo)其朝著我們?cè)O(shè)定的方向發(fā)展。

與微生物發(fā)酵相關(guān)的參數(shù)包括：物理、化學(xué)、生物三類(lèi)。

1、物理參數(shù)包括：溫度、罐壓、攪拌轉(zhuǎn)速、攪拌功率、空氣流量、發(fā)酵液粘度；

2、化學(xué)參數(shù)包括：酸堿度、基質(zhì)濃度、溶解氧濃度、氧化還原電位、中間體物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、比生產(chǎn)速率、尾氣氧含量、尾氣二氧化碳含量；

3、生物參數(shù)包括：菌體濃度、比生長(zhǎng)速率、菌體形態(tài)。

*部分 現(xiàn)行的pH控制理論

*節(jié) 為什么要控制pH值

1. 影響菌體生長(zhǎng)：

每種微生物都有其適合生長(zhǎng)的pH值范圍，原因有二：

（1） 對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的影響：不同的pH值條件下，培養(yǎng)基中各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的穩(wěn)定性不同；各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)不同；有機(jī)碳、氮源的水解或變性不同。進(jìn)而影響菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用。

（2） 對(duì)菌體生物酶活性影響： 培養(yǎng)基中的H⁺或OH^-直接影響胞外生物酶的活性，進(jìn)而影響菌體生長(zhǎng)。

（3） 對(duì)菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響。

（4） 對(duì)菌體細(xì)胞膜荷電影響：引起細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，因而影響菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝物排泄。

2. 影響菌體代謝：

培養(yǎng)基中的H⁺、OH^-首先作用在胞外的弱酸（或弱堿）上，使之成為易于透過(guò)細(xì)胞膜的分子狀態(tài)的弱酸（弱堿），它們進(jìn)入細(xì)胞后，再進(jìn)行解離，產(chǎn)生H⁺或OH^-離子，改變胞內(nèi)原先的中性狀態(tài)，影響酶的結(jié)構(gòu)和活性。進(jìn)而影響菌體代謝。

3. 影響產(chǎn)物穩(wěn)定性：

不同的物質(zhì)有不同的穩(wěn)定pH值范圍。特別是胞外表達(dá)的產(chǎn)物，直接裸露于培養(yǎng)液中，給予合適的pH條件至關(guān)重要。

4. 影響發(fā)酵液的后處理：

（1） pH值直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電荷性質(zhì)

（2） pH值會(huì)影響發(fā)酵液的粘度。

第二節(jié) 是什么原因使pH值產(chǎn)生變化

1. 培養(yǎng)基基質(zhì)：

（1） 成分種類(lèi)、含量及配比，分兩種情況：

其一，成分本身的酸堿特性；

其二，成分經(jīng)過(guò)菌體代謝后呈現(xiàn)出酸堿性：凡是代謝后產(chǎn)生酸性的物質(zhì)，稱(chēng)為生理酸性物質(zhì)；經(jīng)代謝后產(chǎn)生堿性的物質(zhì)，稱(chēng)為生理堿性物質(zhì)。

生理酸性物質(zhì)，如硫酸銨：菌體吸收其中的NH4作為氮源，殘留的SO4與培養(yǎng)液中的H+結(jié)合成硫酸而使pH值降低。

生理堿性物質(zhì)，如硝酸鈉：菌體吸收其中的NO3-量遠(yuǎn)大于對(duì)Na 的吸收量，為保持體內(nèi)電性平衡，細(xì)胞向外界分泌HCO3-或OH-，使溶液的pH值上升。

（2） 培養(yǎng)基滅菌：培養(yǎng)基中基質(zhì)成分在高溫高壓狀態(tài)下發(fā)生變化引起pH改變。

2、 菌體生長(zhǎng)不同階段對(duì)pH影響不同：

（1） 菌體指數(shù)生長(zhǎng)期：本階段pH值迅速降低。

原因如下：

為滿(mǎn)足菌體快速生長(zhǎng)，大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被利用，打破原有體系的pH值體系平衡。

如：碳源代謝：無(wú)論是單糖、雙糖、寡糖還是多糖，均先經(jīng)水解為單糖再被利用，利用后產(chǎn)生有機(jī)酸，使pH值降低。

（2） 菌體生長(zhǎng)平臺(tái)期：菌體生長(zhǎng)、衰亡趨于平衡。pH值基本呈下降，但趨勢(shì)趨緩。若此時(shí)pH快速回升，說(shuō)明碳源被利用完，菌體被迫利用胞內(nèi)有機(jī)酸所致。

（3） 菌體衰亡期：由于菌體衰亡、自溶，pH值迅速回升。

注：若在菌體平臺(tái)期、衰亡期出現(xiàn)pH值迅速下降狀況，原因可能如下：

1） 傳感器故障；

2） 染菌；

3） 補(bǔ)料時(shí)間過(guò)早，前期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)剩余；

4） 補(bǔ)料速率不合理，造成二次生長(zhǎng)。

3、通氣量及罐壓

（1）通氣量不足：

1）引起pH降低：厭氧發(fā)酵，產(chǎn)生大量乳酸pH值降低；另外，通氣量流量小，產(chǎn)生的CO2不能及時(shí)隨尾氣排出，CO2溶于水中，使pH值降低；

2）引起pH值升高：氧氣供應(yīng)不足使菌體衰亡自溶，引起pH值升高。

（2）罐壓太高：一般高于0.03Mpa

引起pH值降低：隨著壓力增高，CO2在水中溶解度增加，因此引起pH值降低。

*節(jié) 發(fā)酵過(guò)程中pH值控制手段

1、 改變培養(yǎng)基中基質(zhì)成分及比例：

每種微生物生長(zhǎng)，以及目的產(chǎn)物的合成對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求有一定的偏好性，因此可以利用來(lái)調(diào)控的空間不大。

2、 培養(yǎng)基中增加緩沖體系：

但需關(guān)注緩沖體系成分對(duì)菌體生長(zhǎng)代謝的影響。

3、 培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)補(bǔ)加碳源來(lái)調(diào)節(jié)pH值

4、培養(yǎng)過(guò)程中使用酸、堿進(jìn)行調(diào)控：

常用酸如：鹽酸、硫酸、醋酸、硝酸等；常用堿如：氫氧化鈉、氨水等。

注意：

（1）氨水可被作為氮源利用，因而打破營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的碳氮比平衡。

（2）酸、堿調(diào)解過(guò)程，會(huì)造成培養(yǎng)液的局部過(guò)酸或過(guò)堿，從而引起局部菌體被灼傷、或代謝物被強(qiáng)酸、強(qiáng)堿破壞。

（3）酸、堿調(diào)控，會(huì)改變培養(yǎng)液的離子強(qiáng)度。

第二部分 本人經(jīng)驗(yàn)分享

*節(jié) 發(fā)酵過(guò)程中pH值變化的本質(zhì)

1、 pH變化的關(guān)鍵原因：除培養(yǎng)基基質(zhì)成分、通氣量和壓力等理、化因素影響外，更多的是菌體生長(zhǎng)代謝過(guò)程的生物因素。

2、 pH值檢測(cè)方法：在線(xiàn)的pH電極即時(shí)測(cè)定；取樣離線(xiàn)的pH計(jì)、pH試紙測(cè)定等。

3、 pH值變化的本質(zhì)：

由pH值測(cè)定方法可以看出，無(wú)論何種方法的測(cè)定值均代表的是菌體生物過(guò)程的結(jié)果，也就是說(shuō)pH值測(cè)定永遠(yuǎn)滯后于菌體的生物過(guò)程。因此，pH值是菌體生物過(guò)程的結(jié)果。

第二節(jié) 基于pH值是生物過(guò)程的結(jié)果理論而形成的發(fā)酵過(guò)程中pH值控制原則和方法

既然pH值是生物過(guò)程的結(jié)果，那么一個(gè)發(fā)酵周期內(nèi)菌體能夠自然的達(dá)到理想的菌體生

長(zhǎng)代謝所需的pH值才是“本”；而基于即時(shí)測(cè)定值而此進(jìn)行的任何調(diào)控均是事后之事，謂之為“末”并不為過(guò)。常規(guī)的pH調(diào)控手段，往往掩蓋了菌體生長(zhǎng)、代謝的真實(shí)狀態(tài)。因而為了控制pH值而控制pH即為“舍本逐末”。

1、pH值的調(diào)控原則：

（1）以前饋?zhàn)鳛檎{(diào)控節(jié)點(diǎn)；

（2）以順勢(shì)引導(dǎo)菌體生產(chǎn)、代謝過(guò)程為調(diào)控依據(jù)；

（3）以測(cè)定的pH值作為對(duì)調(diào)控手段有效性的檢驗(yàn)。

2、pH值的調(diào)控方法：把握前饋節(jié)點(diǎn)，控制菌體生長(zhǎng)速度的方式，使發(fā)酵過(guò)程pH值在理想范圍內(nèi)。

（1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：盡量避免緩沖體系；低濃度的碳、氮源，一般含量不超過(guò)1%；避免碳、氮源比例失衡（不同種類(lèi)微生物、不同的代謝產(chǎn)物 所需碳氮比不同）；

（2）補(bǔ)料培養(yǎng)基配方及補(bǔ)料速率：分三個(gè)階段

*階段：指數(shù)生長(zhǎng)期。

1） 補(bǔ)料配方：碳氮比宜高，且以*碳、氮源為主；

2） 補(bǔ)料速率：控制比生長(zhǎng)速率在30%左右，即可控制pH平緩下降。

生長(zhǎng)速率太低生物量積累太少不利于產(chǎn)物表達(dá)。生長(zhǎng)速率過(guò)高，菌體迅速進(jìn)入衰亡期，pH值變化幅度過(guò)大、生產(chǎn)周期短，進(jìn)而不利于產(chǎn)物積累。

3） 補(bǔ)料節(jié)點(diǎn)：以pH值比變化速率降低為補(bǔ)料節(jié)點(diǎn)（前饋點(diǎn)），可以有效的控制pH值變化，且不會(huì)造成營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩、或營(yíng)養(yǎng)匱乏。

第二階段：平臺(tái)期（初級(jí)代謝產(chǎn)物開(kāi)始積累）。

1） 補(bǔ)料配方：碳氮比縮小，增加遲效碳、氮源。

2） 補(bǔ)料速率：控制生物量基本保持不變，即可控制pH平穩(wěn)。

3） 補(bǔ)料節(jié)點(diǎn)：以pH值比變化速率降低為補(bǔ)料節(jié)點(diǎn)（前饋點(diǎn)）。

第三階段：衰亡期（次級(jí)代謝產(chǎn)物大量積累）

1） 補(bǔ)料配方：碳、氮源濃度僅維持菌體代謝即可。

若過(guò)高則造成菌體二次生長(zhǎng)，使pH值下降。

2） 補(bǔ)料節(jié)點(diǎn)：以pH值比變化速率降低（緩慢回升過(guò)程）為補(bǔ)料節(jié)點(diǎn)，可維持pH值平穩(wěn)。

總結(jié)：

發(fā)酵過(guò)程中的pH值變化是發(fā)酵過(guò)程狀態(tài)體現(xiàn)、是生物生長(zhǎng)代謝的結(jié)果。pH值不是發(fā)酵過(guò)程中需要控制的參數(shù)，而是發(fā)酵過(guò)程控制的依據(jù)和方向標(biāo)。