一、實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

1.器具電子天平、70℃恒溫箱、玻璃制刀機(jī)、半/超薄切片機(jī)、顯微鏡、包埋模、制刀用的玻璃條、鑷子、刀片。

2.試劑

 (1)固定劑：FAA

 (2)脫水劑：20%、40%、60%、80%、90%、95%、100%的乙醇；丙酮

(3)樹(shù)脂：Spurr樹(shù)脂

(4)染色劑：1%堿性品紅

二、實(shí)驗(yàn)步驟

1.取材和固定：取樣時(shí)所用的器具必須干凈，刀、剪等必須鋒利，在操作時(shí)盡量避免拉、鋸、壓等動(dòng)作對(duì)組織細(xì)胞造成的機(jī)械損傷。一般樣品塊的大約為1立方毫米，取材完成后立即放入固定液中，真空泵抽氣兩到三次，每次1-2min（注意不要讓固定液沸出，如抽完后液體較少，可再補(bǔ)加固定液）。

2.脫水：用50%、60%、70%、85%、95%、100%的乙醇分別浸漬固定的材料，每種濃度處理10～15min

3.置換

(1)在管瓶中加入2ml無(wú)水乙醇和1ml丙酮，處理材料10min

(2)向管瓶中追加1ml丙酮，處理材料10min

(3)向管瓶中再追加2ml丙酮，處理材料10min

(4)傾倒出管瓶中的無(wú)水乙醇和丙酮混合液，加入純丙酮3次，每次10min。

4.浸透

(1)在管瓶中加入1ml丙酮，向內(nèi)滴入1滴Spurr樹(shù)脂，1～2h

(2)向管瓶中追加1至數(shù)滴Spurr樹(shù)脂，使Spurr樹(shù)脂的濃度逐漸提高，每滴加一次Spurr樹(shù)脂，放置1～2h，共滴加0.3ml左右的樹(shù)脂，使樹(shù)脂濃度達(dá)到25%左右。

(3)用吸管吸去管瓶中0.5～0.8ml的丙酮和Spurr樹(shù)脂的混合液，然后加入純Spurr樹(shù)脂0.5ml，使樹(shù)脂濃度達(dá)到50%～60%左右，2～3h

(4)用吸管吸去管瓶中的丙酮和Spurr樹(shù)脂的混合液，加入0.5～0.8ml的Spurr樹(shù)脂，2～3h

(5)更換新配制的Spurr樹(shù)脂1ml，過(guò)

(6)重復(fù)換樹(shù)脂3次，每次12h

5.包埋與聚合

(1)先將恒溫箱調(diào)至溫度至70℃，包埋模事前烘干置干燥器中存放。

(2)在濕度小的房間里進(jìn)行包埋操作。在包埋模的中放上已浸透的材料(用牙簽不損傷樣品地桃)，用滴管吸取新配制的Spurr樹(shù)脂，并注滿每個(gè)穴孔，用牙簽撥樣品，使樣品按一定方位(有利修塊、切片和觀察)排列。做好記載(各穴孔中放的是什么樣品

(3) 聚合：將包埋樣品的包埋模放入70℃恒溫箱中聚合，8h后取出置干燥器中存放。多余的樹(shù)脂可放在膠囊中或放在包埋模的穴孔中同樣品一同聚合。

6.修塊

用銼刀或鐵砂皮磨樣品塊，使樣品稍稍暴露，使待切部位呈方形或長(zhǎng)方形，zui后用刀片將樣品塊的磨面切平

7.玻璃刀的制作

用玻璃制刀機(jī)先將玻璃條制成邊長(zhǎng)為25mm的正方塊，然后再將每正方塊制作成2把璃制刀。

8.切片、貼片

(1)固定樣品塊和玻璃刀

將樣品塊和玻璃刀固定在半薄切片機(jī)上，玻璃刀的避樣品角約為5度，切片機(jī)裝樣品部位平放時(shí)，玻璃刀刀口與樣品塊處于同一高度。調(diào)節(jié)玻璃刀前后位置，使刀口接近樣品塊。

 (2)荒切

開(kāi)動(dòng)切片機(jī)，調(diào)節(jié)進(jìn)刀距離和速度，讓玻璃刀荒切樣品塊，使樣品塊的切面逐漸平整光滑起來(lái)。

(3)切片

當(dāng)樣品塊的切面平整光滑后便可正式切片。作為光鏡觀察用的半薄切片厚度一般控制在1-2μm左右。

(4)貼片

當(dāng)切到理想切片時(shí)，用尖頭鑷子夾住切片，并把切片釋放到滴有水滴的載玻片的水滴上，然后將載玻片放到烤片機(jī)上45℃烤片，當(dāng)載玻片上的水滴被烤干時(shí)切片就被貼在載玻片上。

(5) 染將堿性品紅染液均勻覆蓋在載玻片上，45℃烤干，隨后用50%乙醇沖洗，并再次把切片烘干。

(6)封片，觀察

注意：透射電鏡樣品固定液為2.5%戊二醛溶液