許多革蘭氏陰性細菌能產(chǎn)生出一套特定的N-acyl-L-homoserine-lactone（AHL）信號分子感應為目的的一種手段,規(guī)范在cell-density-dependent協(xié)調(diào)基因表達方式。從acylated生產(chǎn)AHLs acyl-carrier蛋白（acyl-ACP）和S-adenosyl-L-methionine AHL合成酶的酶。具體的樣子AHLs由于大部份的固有的特異性酶acyl-ACP基質(zhì)的子集。Pantoea結(jié)構(gòu)的研究stewartii酶EsaI和AHL-sensitive生物測定法顯示,蘇氨酸140在?；`的口袋里的指導酶對生產(chǎn)3-oxo-homoserine lactones。質(zhì)譜是用于檢查范圍的AHL產(chǎn)生的分子物種AHL合成酶下的各種條件。一個AHL選擇性分離純化的加法色譜純化的內(nèi)部標準AHL deuterated緊隨其后的分別是液體reverse-phase chromatography-tandem質(zhì)譜,為了獲得相對量的估計不同的AHLs從生物樣品。生產(chǎn)的AHLs野生及工程EsaI AHL合成酶表明,卡和內(nèi)在的特異性和不同的細胞條件AHLs生產(chǎn)的影響。*百四定位在蘇氨酸的EsaI是很重要的偏愛3-oxo-acyl-ACPs,但其作用相當于在卡蘇尚不清楚。此外,卡在大腸桿菌產(chǎn)生表示比例高的不尋常的AHLs由與?；溒鏀?shù)的碳。此外,這些研究提供額外的方法,將有助于對測量和全身AHLs從不同的來源。

許多革蘭氏陰性菌生產(chǎn)acyl-homoserine lactones（AHLs）細胞的一種信號被稱作感應”,也就是一般相關的致病或公共的行為（回顧文獻39和64）。至少70多種細菌產(chǎn)生AHLs,而從分子鏈的長度,C4植物酰醇C18。此外,AHLs可以有不同程度的非飽和在C-7或C-8位置,以及氧化在第三的位置（圖1）,（15,36歲）。大多數(shù)細菌產(chǎn)生一個受限制的范圍,AHLs強耦合的選擇性AHL自己的檢測機械,利用轉(zhuǎn)錄監(jiān)管機構(gòu),如我們所知的R-proteins的選擇性的結(jié)合,是AHL激活或抑制許多下游的靶基因（53 55歲60人）。這一明顯的耦合具有導致AHL生產(chǎn)的觀念,相對限制在物種信號有別于interspecies信號（21）。

內(nèi)在的專一是對AHL合成酶acyl-acyl為子集的載體蛋白（acyl-ACP）基體的重要因素AHLs生產(chǎn)特別。合成的細胞中AHLs由AHL合成酶酵素基質(zhì)是常見的組成部分,acyl-ACP細胞的新陳代謝,S-adenosyl-L-methionine（40條、第46條）。Pantoea stewartii酶的酶EsaI和銅綠假單胞菌3-oxo-C6-homoserine內(nèi)酯（生產(chǎn)優(yōu)先卡）,分別3-oxo-C12-HSL好舒（1、48）。這兩種酶結(jié)構(gòu)的研究顯示一種常見的結(jié)合進行acyl-ACP phosphopantetheine假肢集團、建模研究的一個特定的蘇氨酸與acyl-chain結(jié)合為作為一個重要的氫鍵的位置3-oxo acyl-ACP（17,62）。此外,比較AHL合成酶序列及其AHLs他們會產(chǎn)生建議蘇氨酸,在這一位置與生產(chǎn)3-oxo-HSLs,而丙氨酸和甘氨酸結(jié)合unsubstituted和色氨酸的AHLs與生產(chǎn)3-hydroxy-HSLs。AHLs產(chǎn)生的EsaI和蘇氨酸140-to-alanine替代變種生物被定義為使用兩個敏感的記者,展現(xiàn)一個戲劇性的轉(zhuǎn)變生產(chǎn)AHL在3-oxo-C6-HSL野生型郵寄）在C6-HSL變異（62）。盡管這化驗證實殘留在作用,為3-oxo-acyl-ACP AHL合成酶特異性,真正的特異性不能使用這個AHL檢測方法進行評估。

能被探測到AHLs有效利用生物AHL-sensitive在溶液中或thin-layer-chromatography（TLC）覆蓋格式。薄層層析覆蓋化驗被廣泛用于確定種類,所產(chǎn)生的AHLs特定細菌,或說得更具體特定AHL合成酶,因而55）。這些生物分析是靈敏度高、檢測能力sub-picomole大量的特定的AHLs。不過,有一個內(nèi)在檢測偏見、因為他們指望特定的特異性為記者應變是用來檢測方面AHL Chromobacterium violaceum（37）,農(nóng)桿菌機理TraR）（55（綠膿桿菌）,或者LasR）（48）。在記者近期發(fā)展提供了一定的菌株相對混淆檢測系統(tǒng)是認識更為廣泛的AHLs（49,66歲）。然而,對已知的*的范圍AHLs、多記者株必須裝備全套的標準,來評定哪些點對應各具體的信號（7）。

質(zhì)譜（MS）和氣相色譜AHL -MS提供替代方法的檢測,該結(jié)果是基于物理/化學性能的化合物,如大眾/費用比collisionally誘導分子離子,產(chǎn)品離子、和色譜保留性質(zhì)。Derivatization已經(jīng)被使用了AHLs的星座考試3-oxo-HSLs用氣相色譜-質(zhì)譜（8）。直接分析已經(jīng)被報道AHLs采用氣相色譜-質(zhì)譜（6）和液相色譜（HPLC）耦合離子阱質(zhì)譜（質(zhì)）（36,41 15,17,43,44,48,59歲）。增加了一個預濃縮措施已經(jīng)被報道的高度敏感的結(jié)果,在AHL檢測的方法（13、14）。

作者描述的方法結(jié)合起來的一種顯示AHLs變化與突變的分布引入兩個AHL合成酶,EsaI和卡。根據(jù)實驗AHLs分布的液體chromatography-electrospray取決于標本ionization-tandem質(zhì)譜（LC / MS / MS）triple-quadrupole質(zhì)譜儀使用。我們研究了活性部位的影響的threonines EsaI和卡的特異性的綜合,以及AHL貢獻目的語文化背景知識的不同的細菌產(chǎn)生的各種各樣的AHLs這些AHL合成酶體內(nèi)。

材料和方法

AHL術語。簡短起見,一個?；溡粋€具體的長度是由等號前“Cn”為數(shù)量的碳在鏈條,而不是化學名（即是hexanoyl C6）,和替代類型和職位或3-oxo 3-hydroxy（如3-oxo-C6-HSL）。D3表明,AHL包含三個氘原子的位置在終端?；?。

D3-C6-homoserine內(nèi)酯的合成。固相carbodiimide,可用于合成化學D3-C6-HSL,使用N-cyclohexylcarbodiimide-N的-propyloxymethyl聚苯乙烯樹脂（PS-carbodiimide;Argonaut技術）（12,45）。脂肪酸D3-hexanoic酸（34.5μmol[第4.11章毫克]）（劍橋同位素400加入二氯甲烷的μl（以10%的氮、N-dimethylformamide）在另一個玻璃反應小瓶里。這種反應瓶,40毫克的PS-carbodiimide和混合氣添加了點5分鐘室溫。脂肪酸后,以平衡被允許與樹脂的,4.2個毫克（23μmol）——-amino butyrolactone溴酸右美沙芬（HSL-HBr）（奧爾德里奇）溶解在200μl以10%的氮、N-dimethylformamide和4.6μmol 6.4μl）（triethylamine（隨后的分析顯示沒有顯著lactonolysis產(chǎn)品時使用triethylamine為基礎[數(shù)據(jù)未顯示）,攪拌加入30小時室溫。反應包括檢查resin-bound基質(zhì)中濾除耦合/中介,固相萃取如下所述為AHL提取物。D3-C6-HSL的產(chǎn)品是resuspendedzui后在甲醇濃度的200μM。這稀釋,體現(xiàn)LC / MS相當于0.2 nmol C6-HSL的,用于所有剩下的實驗（見圖4B）。

誘變的LasIG質(zhì)粒。撰寫LasIG替換是由pLasIG使用QuikChange誘變方法（Stratagene）為每一個突變互補底漆顯示在表1。這些突變經(jīng)限制,如果可能,分析消化和DNA測序整個基因。

acyl-homoserine lactones的提取和純化為質(zhì)譜分析。大腸桿菌株（表1）,而為AHL質(zhì)粒表達stewartii從第EsaI合成酶和pLasI和pLasIG從銅綠假單胞（18支全壘打,61）,種植在5-ml文化在Luria-Bertani（磅）湯μg / ml的100°C孕37氨芐戰(zhàn)兢12到16小時。每一種文化都是1稀釋到10毫升的新鮮磅湯100μg / ml氨芐西林和孵化到細胞密度達到一種密度的600海里（OD600 0.6 - 0.8。溫度降至25°C,持續(xù)15分鐘,經(jīng)過equilibration,每一種文化都引起增加IPTG（異丙——D-thiogalactopyranoside）0.5毫米。培養(yǎng)是孵化為25°C 6 ~ 8小時搖和法。文化的銅綠假單胞種植在同樣的方式,除了應變PAO1 PAO214并不需要抗生素和應變與pEX30-las 500μg / ml carbenicillin要求。文化進行處理supernatants在離心10分鐘x 3200號,其次是decanting成一個20-ml注射器,通過一個0.2-μm過濾器。在尚未準備樣品的定量分析,nmol由0.4添加D3-C6-HSL每10毫升的文化上清收獲后但在過濾。提取的文化supernatants兩次10毫升的酸性,乙酸乙酯（0.1毫升/升醋酸）,和9個曼梯·里從每個萃取是混合的了,2-ml*干燥在玻璃樣品瓶。這提取時間、提取預計至少75%的3-oxo-C6-HSLs。AHLs也取得商業(yè)來源（σ,公司法定人數(shù)科學）。

初始凈化AHL分子物種被了固相萃取。每份樣品redissolved,在100μl甲醇（*解,西格瑪）,應用于9月啟動Pak加上硅墨盒（水,都配有一個6-ml玻璃反應瓶、附在真空在靜聽著的松林之間。模組,已經(jīng)被活化6毫升的連續(xù)油水各溶劑在以下序列:平等的大量的isooctane和乙醚（乙醚防腐劑不得有簡單有效,看成分蠻清爽）,酸性,isooctane乙酸乙酯和乙醚。樣品,在甲醇溶劑中添加到5毫升isooctane-ethyl醚,pipetted入反應瓶、然后裝到SPE墨盒。固相萃取的洗了兩次筒6毫升的isooctane-ether然后eluted到進玻璃杯分數(shù)管5 - 8毫升的酸性乙酸乙酯。經(jīng)過凈化的樣品被送往干燥采用真空制鹽附近,然后移交給一個玻璃autosampler瓶是蒸發(fā)*。在redissolved樣本50年或100μl甲醇和限定。

/環(huán)己烷可以使用的地方isooctane作為溶劑凈化手術,但是雜質(zhì)含量/環(huán)己烷reagent-grade了電噴霧離子m / z 284和228個在AHL分析。因此,prepurified /環(huán)己烷是在固相萃取才能通過筒之前被用于凈化AHLs細胞培養(yǎng)質(zhì)量。真正的AHLs是被LC / MS / MS在多反應監(jiān)測（MRM）實驗,當基因轉(zhuǎn)移從母體離子兩?；蛢?nèi)酯基重疊峰相比,與已知標準評價色譜保留時間。停留時間分析方法能夠區(qū)分出C（n）-HSL和3-oxo-C（n-1）-HSL分子物種,也有類似的群眾（數(shù)據(jù)未顯示）。

LasR記者的分析方法。LasR記者應變大腸桿菌的MG4 / pKDT17a（48歲,52）是一夜之間就在一個中號（52）,以1毫米MgSO4和100μg / ml氨芐西林30°C。每個萃取1毫升的稀釋產(chǎn)業(yè)文化（增加到一個OD600 0.1）的5到6小時30°C。威爾森說︰樣本來分析-galactosidase活動所使用磨房主分析法（16,38）。

液相色譜。樣本LC / MS和LC / MS / MS分析在100 resuspendedμl甲醇和10μl在注射2.0-mm reverse-phase由150.0-mm哥倫布C18柱（Phenomenex）操作在流量達到200μl /分鐘廢水直接進入質(zhì)譜儀流動。溶劑一個由水含有0.1%冰醋酸B、溶劑組成的甲醇冰醋酸含有0.1%。一個梯度洗脫方法在5%開始利用溶劑在五分鐘,到95%的溶劑B超過30分鐘,仍然在95%等靜溶劑B,持續(xù)15分鐘。reequilibrated柱是5分,一個空白的zui終被相互之間進行分析。這梯度優(yōu)化broad-range檢測是降低zui初的有機濃度的制度,但它可以輕易被調(diào)整,使之更好的獨立,longer-acyl-chain都AHLs短。

質(zhì)譜法。光譜分析質(zhì)量進行了API-3000體育Sciex triple-quadrupole串聯(lián)質(zhì)譜（Perkin-Elmer生命科學、特霍西爾,安大略,加拿大）。ion-scanning實驗前兆進行第三positive-ion模式設置為顯示器的m / z此類證券就達到1022和*集掃描大量范圍的m / z 50到m / z 400 5秒。該儀器參數(shù)如下:離子噴霧電壓為4200 V,declustering潛力的潛力,以50 V碰撞200 V,氮是25五、作為碰撞氣體。

多個反應監(jiān)測試驗研究了使用相同的液相色譜條件和邁克爾-舒馬赫參數(shù)前所述。離子的*節(jié)和第三監(jiān)測顯示在表2是為每個AHL。這些離子過渡與從母體離子的每一個都AHL基酰[M + H-101]+,以及內(nèi)酯基在M / z 102（圖磅）對于每一種AHLs標識在不斷的前兆ion-scanning實驗,以及其他AHLs預測要出席。

AHLs的定量分析。標準曲線進行了1-mg / ml股票解AHLs以下各位在甲醇溶劑中:3-oxo-C6-HSL（西格瑪）,C6-HSL（Fluka）,C12-HSL（Fluka）。股票解決方案（包括5毫米）,在甲醇產(chǎn)量增加到連續(xù)1000,200,濃度40歲,8個,1.6μM。對于每一種分,10μl標準曲線各稀釋是加到一autosampler每小瓶含0.4 nmol D3-C6-HSL內(nèi)部標準的甲醇。標準曲線進行樣品MRM使用相同的液相色譜條件和儀器前述參數(shù)。測物的峰面積結(jié)合使用定量分析軟件（Perkin-Elmer 1.2;）。相比產(chǎn)生的標準曲線的比率分析物的區(qū)域的山峰和內(nèi)部標準品量之比分析物的每個標本中的和內(nèi)部標準（見結(jié)果）。每個綜合高峰是手動,檢查,并對數(shù)據(jù)進行規(guī)范化到內(nèi)標峰的地區(qū)。

結(jié)果

想了解AHL合成酶達到這樣的高的特異性在AHL信號產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中所扮演的角色,我們檢測了EsaI和threonines*百四蘇卡、144 142比較的AHL野生產(chǎn)品和突變的酶。AHL合成酶活性的測定內(nèi)在特異性就利用不同的acyl-ACPs為基體的親和力、公里需要測量值的范圍廣泛的acyl-ACPs。不僅是難以作出足夠數(shù)量的acyl-ACPs進行這類學習（26,32歲）,但是它也會有必要了解身份工作,而且還要能夠自己作出所有相關的AHLs。雖然AHLs可以進行使用常用的記者應變生物傳感器、整體的分析需要多個記者品種和眾多的標準來檢測和確認許多不同的AHLs。此外,記者株存有偏見為某一特定范圍的酰鏈以及替代在第三的位置。從而更快速、less-biased分析AHL合成酶特異性比可以達成以凈化acyl-ACPs或AHL記者生物測定法,我們用質(zhì)譜研究范圍的AHLs由各酶表達了大腸桿菌在多種情況下。

從AHLs的凈化質(zhì)量。分析了產(chǎn)生的AHLs本國或突變也AHL合成酶,這是必須先把信號由這些酶。生產(chǎn)的AHLs革蘭氏陰性菌分享homoserine內(nèi)酯環(huán)和容易彌漫或出口的細菌細胞培養(yǎng)上清（30）。由于其固有的特性,AHLs提取細胞培養(yǎng)等有機溶劑上清乙酸乙酯（37）。減輕作業(yè)量內(nèi)酯水解及隨后的儲存在檢查,乙酸乙酯輕微被加上了酸性0.1毫升/升醋酸前55歲,提取65）。另外,AHLs與其他可提取溶劑,如二氯甲烷,這可以提取3-oxo和更有效的3-hydroxy-HSLs比乙酸乙酯、或AHLs獲得完整細胞利用卜萊的提取工藝和戴爾脂質(zhì)（2）?；衔锏幕旌衔锏挠嘘P分子量在這兩種情況下是很復雜的,它有幫助凈化AHLs污染的油脂和小分子。

固相萃取分離純化的條件下能分離AHLs雜質(zhì)基于一種普遍的化學結(jié)構(gòu),極地的性質(zhì)的homoserine內(nèi)酯的戒指。發(fā)展的商業(yè)AHLs凈化協(xié)議用乙酸乙酯提取物的大腸桿菌supernatants從細胞表達文化AHL合成酶的酶。薄層色譜分離純化的優(yōu)化分析方法對固相萃取溶劑系統(tǒng),3-oxo-C12-HSL純化3-oxo-C6-HSL乙酸乙酯萃取物,100-ml的LasIG文化。LasR記者的生物被用來跟蹤洗脫的信號,AHL,如圖2。乙酸乙酯洗脫已恢復輸入信號,這是滿足這一分析的,因為一個內(nèi)部標準能糾正任何損失從生產(chǎn),不能再進一步的重大損失AHL已見用固相萃取技術的清洗步驟。這個過程消除了之前需要完成薄層色譜分析質(zhì)量,減少了光譜分析樣品的復雜性,要檢查AHLs集中。