干貨！腦漿組織如何提取外泌體

外泌體是由細(xì)胞內(nèi)多泡體與細(xì)胞膜融合后，釋放到細(xì)胞外的一種直徑約30 ~ 150 nm的膜性囊泡。幾乎所有的細(xì)胞都會產(chǎn)生外泌體，被分泌出的外泌體會進(jìn)入各種體液，通過循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)其他細(xì)胞與組織，產(chǎn)生遠(yuǎn)程調(diào)控作用。

         越來越多的研究表明神經(jīng)系統(tǒng)中的生理功能和病理功能與外泌體密切相關(guān)，例如：參與神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)元活動，參與神經(jīng)退行性疾病調(diào)控等。

    本文中整理了一種可以從腦漿組織中分離和提取外泌體的操作步驟，供大家參考！

相關(guān)試劑：

1，Hibernate E Solution （BrainBits, Springfield）

2，木瓜蛋白酶papain（Worthington）

3，Umibio Exosome Isolation Kit

4，PBS

相關(guān)設(shè)備：

1，勻漿器

2，網(wǎng)狀過濾器40-μm

3，注射器過濾器 0.2μm

4，高速離心機(jī)

5，渦旋振蕩器

操作步驟：

一）腦漿液化處理：

1，將新鮮或先前冷凍的小鼠半腦切開，加入Hibernate E溶液 (3 mL /半腦)；

2，加入20單位/ mL的木瓜蛋白酶，在37℃水浴15分鐘；

3，加入等體積預(yù)冷Hibernate E后，輕輕勻漿；勻漿過程中在冰上進(jìn)行；

4，腦勻漿通過40-μm網(wǎng)狀過濾器過濾；

5，濾液再通過0.2-μm過濾器過濾，收集濾液；

二）液化腦漿預(yù)處理；

1，離心去碎片：將液化腦漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，于4℃以3000 g離心10 min，去除濾液中的碎片；離心后上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中；

2，離心去雜質(zhì)：轉(zhuǎn)移后的上清液于4℃以10000 g離心20 min，去除樣品中雜質(zhì)，將離心后的上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中；

三）腦漿外泌體的提??；

通過Umibio Exosome Isolation Kit提取外泌體顆粒。

1，上清液預(yù)處理：在去除雜質(zhì)的離心上清液中加入Exosomoe Concentration Solution（ECS試劑），具體的加入劑量如下：

注：其他劑量規(guī)格請根據(jù)表中的試劑用量等比例換算

2，溶液混合：加入ECS試劑后將離心管蓋緊，通過渦旋振蕩器混勻1 min，再放置于2℃至8℃靜置2 h；

3，沉淀外泌體：取出裝有混合液的離心管于4℃以10000 g離心60 min，棄上清，沉淀中富含外泌體顆粒；（注：盡可能吸凈上清液）

4，外泌體重懸：取100μL 1×PBS均勻吹打離心沉淀物，待其均勻懸浮在PBS中后，將重懸液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中；

5，收獲外泌體顆粒：將含有重懸液的1.5 mL離心管于4℃以12000 g離心2 min，保留上清液，該上清液中富含外泌體顆粒。（注：若離心沉淀物肉眼可見，再離心一次）

6， 純化外泌體：將收獲的外泌體顆粒粗品轉(zhuǎn)入Exosomoe Purafication Filter（EPF柱）上室中，于4℃以3000 g離心10 min，離心后收集EPF柱管底的液體，此液體即為純化后的外泌體顆粒；

7，外泌體的保存：純化后的外泌體以保存于-80℃低溫冰箱中，以備后繼實(shí)驗(yàn)使用。

參考文獻(xiàn)：

         1， J Biol Chem. 2012 Dec 14;287(51):43108-15.

    2，J Extracell Vesicles. 2017 Jul 26;6(1):1348885.