目的基因

LB培養(yǎng)基

離心管 離心機(jī) 水浴鍋 漩渦振蕩儀

一、目的基因的確定

1.  檢索文獻(xiàn)獲取有實(shí)驗(yàn)證明有效的靶點(diǎn)序列（核對(duì)）。

2.  NCBI查閱

3.  搜索引擎輔助

二 、設(shè)計(jì)siRNA靶序列

在制備siRNA 前都需要單獨(dú)設(shè)計(jì)siRNA序列.研究發(fā)現(xiàn)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞,有效的siRNAs是21-23個(gè)堿基大小、3’端有兩個(gè)突出堿基的雙鏈RNA；而對(duì)非哺乳動(dòng)物，比較有效的是長片段dsRNA。siRNA的序列專一性要求非常嚴(yán)謹(jǐn)，與靶mRNA之間一個(gè)堿基錯(cuò)配都會(huì)顯著削弱基因沉默的效果。

1.  選擇siRNA靶位點(diǎn)

從轉(zhuǎn)錄AUG起始密碼子開始，搜尋下游AA序列，記錄跟每個(gè)AA 3’端相鄰的19個(gè)核苷酸作為候選的siRNA靶位點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示GC含量在30%-50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。Tuschl等建議在設(shè)計(jì)siRNA時(shí)不要針對(duì)5'和3'端的非編碼區(qū)（untranslated regions,UTRs），原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會(huì)影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。

2.  序列同源性分析

將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人或者小鼠、大鼠等等）進(jìn)行比較,排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成.并非所有符合條件的siRNA都一樣有效,其原因還不清楚，可能是位置效應(yīng)的結(jié)果,因此對(duì)于一個(gè)目的基因，一般要選擇3-5個(gè)靶位點(diǎn)來設(shè)計(jì)siRNA。

通常來說，每個(gè)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)3-4對(duì)siRNAs，選擇有效的進(jìn)行后續(xù)研究。

3.  設(shè)計(jì)陰性對(duì)照

一個(gè)完整的siRNA實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有陰性對(duì)照，作為陰性對(duì)照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA中的堿基序列打亂。當(dāng)然，同樣要保證它和其他基因沒有同源性。

三、表達(dá)載體的選用

1.  化學(xué)合成與體外轉(zhuǎn)錄方法都是在體外得到siRNA后再導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，但是這兩種方法主要有兩方面無法克服的缺點(diǎn)：siRNA進(jìn)入細(xì)胞后容易被降解；進(jìn)入細(xì)胞siRNA在細(xì)胞內(nèi)的RNAi效應(yīng)持續(xù)時(shí)間短.針對(duì)這種情況，出現(xiàn)了質(zhì)粒、病毒類載體介導(dǎo)的siRNA體內(nèi)表達(dá)。該方法的基本思路是：將siRNA對(duì)應(yīng)的DNA雙鏈模板序列克隆入載體的RNA聚合酶III的啟動(dòng)子后，這樣就能在體內(nèi)表達(dá)所需的siRNA分子。這種方法總體的優(yōu)點(diǎn)在于不需要直接操作RNA，能達(dá)到較長時(shí)間的基因沉默效果。

2.  通過質(zhì)粒表達(dá)siRNAs大都是用Pol III啟動(dòng)子啟動(dòng)編碼shRNA(small hairpin RNA)的序列。選用Pol III啟動(dòng)子的原因在于這個(gè)啟動(dòng)子總是在離啟動(dòng)子一個(gè)固定距離的位置開始轉(zhuǎn)錄合成RNA，遇到4—5個(gè)連續(xù)的U即終止，非常。當(dāng)這種帶有Pol III 啟動(dòng)子和shRNA模板序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，這種能表達(dá)siRNA的質(zhì)粒確實(shí)能夠下調(diào)特定基因的表達(dá)，可抑制外源基因和內(nèi)源基因。采用質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)在于，通過siRNA表達(dá)質(zhì)粒的選擇標(biāo)記，siRNA載體能夠更長時(shí)間地抑制目的基因表達(dá)。當(dāng)然還有一點(diǎn)，那就是由于質(zhì)?？梢詮?fù)制擴(kuò)增，相比起其它合成方法來說，這就能夠顯著降低制備siRNA的成本。

3.  帶有抗生素標(biāo)記的siRNA表達(dá)載體可用于長期抑制研究，通過抗性輔助篩選，該質(zhì)?？梢栽诩?xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)數(shù)星期甚至更久。同時(shí)RNAi-Ready表達(dá)載體還能與逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒表達(dá)系統(tǒng)整合（BD Knockout RNAi Systems），大大提高siRNA表達(dá)載體對(duì)宿主細(xì)胞的侵染性,*克服某些細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低的障礙，是實(shí)現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞siRNAs瞬時(shí)表達(dá)與穩(wěn)定表 達(dá)的理想工具。

四、合成模板

1.  合成編碼 shRNA的DNA 模板的兩條單鏈，模板鏈后面接有RNA PolyIII聚合酶轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn)，同時(shí)兩端分別設(shè)計(jì) BamH I 和 Hind III 酶切位點(diǎn)，可以克隆到 siRNA 載體多克隆位點(diǎn)的 BamH I 和 Hind III 酶切位點(diǎn)之間。
 

2.  95℃，5 min，緩慢退火， DNA 單鏈得到 shRNA 的 DNA 雙鏈模板。

五、連接與轉(zhuǎn)化

1.  將100 μl感受態(tài)細(xì)胞于冰上解凍。

2.  取5 μl連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)幾次以混勻內(nèi)容物，在冰上放置30分鐘。

3.  將管放入預(yù)加溫到42℃的水浴中，熱激90秒。快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1~2分鐘。

4.  每管中加700 μl LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，進(jìn)行復(fù)蘇。

5.  室溫4 000 rpm離心5分鐘，棄去上清后，用剩余100 μl培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并涂布到含抗性的LB瓊脂平板表面.注意：細(xì)胞用量應(yīng)根據(jù)連接效率和感受態(tài)細(xì)胞的效率進(jìn)行調(diào)整。

6.  將平板置于室溫直至液體被吸收。

7.  倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12~16小時(shí)后可出現(xiàn)菌落。

六、PCR鑒定和測(cè)序鑒定

在插入編碼shRNA的DNA雙鏈模板兩側(cè)設(shè)計(jì)鑒定PCR引物，擴(kuò)增片段在100-200，bp之間。

1. 從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3’端的19個(gè)堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。

Tuschl等建議在設(shè)計(jì)siRNA時(shí)不要針對(duì)5’和3’端的非編碼區(qū)（untranslated regions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會(huì)影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。

2. 將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）

3.  選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的siRNA，以找到有效的siRNA序列。

4.  一個(gè)完整的siRNA實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有負(fù)對(duì)照，作為負(fù)對(duì)照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和其他基因沒有同源性。

如果計(jì)劃合成siRNA，那么可以直接提供以AA打頭的21個(gè)堿基序列，廠家會(huì)合成一對(duì)互補(bǔ)的序列。注意的是通常合成的siRNA是以3’dTdT結(jié)尾，如果要UU結(jié)尾的話通常要特別說明。有結(jié)果顯示，UU結(jié)尾和dTdT結(jié)尾的siRNA在效果上沒有區(qū)別。因?yàn)檫@個(gè)突出端無需和靶序列互補(bǔ)。

一、siRNA操作成功要點(diǎn)

1. 對(duì)每個(gè)基因設(shè)計(jì)并檢測(cè)兩到四個(gè)siRNA序列

為了找到潛在靶位點(diǎn)，掃描靶基因中的AA序列。記錄每個(gè)AA 3’端19個(gè)核苷酸作為潛在siRNA靶位點(diǎn)。潛在靶位點(diǎn)需通過GENBANK數(shù)據(jù)庫的BLAST分析，去除那些與其它基因明顯同源的靶位點(diǎn)。如果可能，siRNA應(yīng)根據(jù)mRNA低二級(jí)結(jié)構(gòu)的區(qū)域設(shè)計(jì)。

2.  選擇低GC含量的siRNA

Ambion公司研究發(fā)現(xiàn)GC含量在40-55%的siRNA比55%以上的活性高。

3.  純化體外轉(zhuǎn)錄siRNA

在轉(zhuǎn)染前要確認(rèn)siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結(jié)合，洗脫(Ambion siRNA體外合成試劑盒中已包括純化柱保證siRNA純度)或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應(yīng)中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學(xué)合成的RNA通常需要跑膠電泳純化(即PAGE膠純化)。

4.  避免RNA酶污染

微量的RNA酶將導(dǎo)致siRNA實(shí)驗(yàn)失敗。由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發(fā)，所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品…因此保證實(shí)驗(yàn)每個(gè)步驟不受RNA酶污染非常重要。Ambion公司在這方面有一整套的產(chǎn)品線，如除RNA酶的噴劑，拭紙及液劑，檢測(cè)和去除RNA酶。

5.  健康的細(xì)胞培養(yǎng)物和嚴(yán)格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性

通常，健康的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高。此外，較低的傳代數(shù)能確保每次實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞的穩(wěn)定性。為了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，推薦用50代以下的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率會(huì)隨時(shí)間明顯下降。

6. 避免適用抗生素

Ambion公司推薦從細(xì)胞種植到轉(zhuǎn)染后72小時(shí)期間避免使用抗生素?？股貢?huì)在穿透的細(xì)胞中積累毒素。有些細(xì)胞和轉(zhuǎn)染試劑在siRNA轉(zhuǎn)染時(shí)需要無血清的條件。這種情況下，可同時(shí)用正常培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基做對(duì)比實(shí)驗(yàn)，以得到較好轉(zhuǎn)染效果。QIAGEN推出的專門針對(duì)RNA轉(zhuǎn)染的試劑

7.  選擇好的轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染siRNA

針對(duì)靶細(xì)胞類型，選擇好的轉(zhuǎn)染試劑和優(yōu)化的操作對(duì)siRNA實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。siRNA實(shí)驗(yàn)要求選擇適合轉(zhuǎn)小的RNA的轉(zhuǎn)染試劑(目前大多數(shù)轉(zhuǎn)染試劑都針對(duì)轉(zhuǎn)染比較大的質(zhì)粒DNA，而非小的RNA分子，宿主范圍大小也不同)。Ambion公司的Silencer siRNA Transfection Kit，QIAGEN的Transmessenger Transfection Reagent都是專門針對(duì)轉(zhuǎn)siRNA優(yōu)化的轉(zhuǎn)染試劑，是您的理想選擇。

8.  通過合適的陽性對(duì)照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測(cè)條件

對(duì)大多數(shù)細(xì)胞，看家基因是較好的陽性對(duì)照。將不同濃度的陽性對(duì)照的siRNA轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞(同樣適合實(shí)驗(yàn)靶siRNA)，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后統(tǒng)計(jì)對(duì)照蛋白或mRNA相對(duì)于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的降低水平。過多的siRNA將導(dǎo)致細(xì)胞毒性以至死亡。Ambion公司提供多種靶基因的陽性siRNA。

9.  通過陰性對(duì)照siRNA排除非特異性影響

合適的陰性對(duì)照可通過打亂活性siRNA的核苷酸順序設(shè)計(jì)而得。必須注意它要進(jìn)行同源比較確保相對(duì)所要研究的生物的基因組沒有同源性。

10.  通過標(biāo)記siRNA來優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

熒光標(biāo)記的siRNA能用來分析siRNA穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。標(biāo)記的siRNA還可用作siRNA胞內(nèi)定位及雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)(配合標(biāo)記抗體)來追蹤轉(zhuǎn)染過程中導(dǎo)入了siRNA的細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染與靶蛋白表達(dá)的下調(diào)結(jié)合起來。