一、原理：

 本實驗采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法。用抗人 NT-pro BNP 單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的 NT-pro BNP與單抗結合，加入生物素化的抗人NT-pro BNP，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結合，加入底物工作液顯藍色，后加終止液硫酸，在450nm處測OD值，NT-pro BNP濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中NT-pro BNP濃度。

二、試劑盒組成（2-8℃保存）：

三、準備試劑與收集血樣：

1. 10×標本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。
2. 收集標本：血清、血漿（EDTA、檸檬酸鹽、肝素抗凝）、細胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿等盡早檢測，2-8℃保存48小時；更長時間須冷凍（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反復凍融。
3. 標準品液配制：取8個1.5ml離心管，管加標本稀釋液900ul，第二至第八管加入標本稀釋液500ul。在管中加入6400pmol/L的標準品溶液100ul置于漩渦混合器上混勻后用加樣器吸出500ul，移至第二管。如此反復作對倍稀釋，從第七管中吸出500ul棄去。第八管為空白對照。
4. 洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）

四、檢測程序：

1. 加樣：每孔各加入標準品或待測樣品100ul，將反應板置振蕩器（400-500rpm）室溫（18-25℃）120分鐘。
2. 洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。
3. 每孔加入蒸餾水和抗體工作液各50ul(空白除外)。將反應板充分混勻后置37℃20分鐘。
4. 洗板：同前。
5. 每孔加酶標抗體工作液100ul。將反應板置37℃10分鐘。
6. 洗板：同前。
7. 每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗處反應15分鐘。
8. 每孔加入100ul終止液混勻。
9. 30分鐘內(nèi)用酶標儀在450nm處測吸光值。

五、結果計算與判斷：

1. 所有OD值建議減除空白值后再行計算。如空白OD低于0.1，也可以直接計算。
2. 以標準品640、320、160、80、40、20、10、0 pmol/L為橫坐標，OD值為縱坐標，使用軟件作圖，畫出標準曲線。NT-pro BNP(1-76 )單位換算，1pmol/L=8.475pg/ml。
3. 根據(jù)樣品OD值計算出相應NT-pro BNP含量即可。軟件可以向本公司郵件索取。

六、試劑盒性能：

1.靈敏度：小的NT-pro BNP 檢測濃度小于4pmol/L。

2.特異性：可同時檢測重組或天然的人NT-pro BNP。不與人其它細胞因子有交叉反應。

3.重復性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10％。

七、注意事項：

1.以上標準孔及待測樣品均建議做復孔，每次測定應同時做標準曲線。

2.洗滌過程很關鍵。洗滌不充分將導致度誤差及OD值錯誤地升高。

3.檢測時所有試劑都要恢復到室溫。板條開封后剩余板條要封好，保持板條干燥。

4.試劑盒使用超敏TMB溶液，若顯色過深會出現(xiàn)絮狀物，屬正?，F(xiàn)象，不影響結果判讀。

5.說明書中試劑盒組成為96T的量，48T的量應減半！

6.本試劑盒宜置4^oC冰箱保存。僅用于科研，不能用于臨床診斷！