小奧課堂又來啦！

這一次干貨滿滿喲，

快來看看ELISA在生物藥研發(fā)中的直接法實(shí)驗(yàn)方案吧！

一、前言

ELISA在生物藥物研發(fā)的各個(gè)環(huán)節(jié)均有廣泛的應(yīng)用：

如以生物大分子檢測為目的，在藥效藥代評估時(shí)，對動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)中的血液樣品的藥物濃度和生物大分子標(biāo)志物進(jìn)行定量檢測；

以親和力測定為目的，在質(zhì)量分析過程中，對抗體相對于靶點(diǎn)抗原的親和力檢測；

以親和力篩選為目的，在抗體發(fā)現(xiàn)過程中，對雜交瘤細(xì)胞克隆上清分泌抗體相對于靶點(diǎn)抗原的親和力大小進(jìn)行區(qū)分等。

使用目的不同，則需要選取不同特性試劑耗材。

參差多態(tài)方顯世界精彩，ELISA方法學(xué)開發(fā)也是一個(gè)道理。

本篇為ELISA方法開發(fā)構(gòu)建的的幾大實(shí)例之一——生物大分子檢測的定量方法開發(fā)的具體實(shí)驗(yàn)方案，適用于所有初接觸ELISA方法技術(shù)且有志于進(jìn)行ELISA方法開發(fā)建立的同仁。

有多精彩，且往下看：

二、ELISA定量方法的類型和構(gòu)架

采用ELISA技術(shù)進(jìn)行定量的平臺(tái)化方法——一般來說可以分為兩類，即間接法和直接法。

間接法也稱為競爭法，直接法也稱雙抗夾心法。

今天，我們重點(diǎn)為大家介紹直接法。

直接法以定量抗原為例：

首先，以與抗原有強(qiáng)親和力的抗體包被固定在酶標(biāo)板材上，加入抗原標(biāo)準(zhǔn)品/樣品反應(yīng)，再加入與抗原有強(qiáng)親和力的抗體并且偶聯(lián)了辣根過氧化氫酶HRP/堿性磷酸酶AP的酶聯(lián)抗體反應(yīng)，后加入酶對應(yīng)的底物顯色，中間通過洗滌去除反應(yīng)體系中未結(jié)上的試劑成分。

這樣信號(hào)大小和抗原的濃度成正相關(guān)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行酶標(biāo)板材上固定的成分由抗體，轉(zhuǎn)變?yōu)榭贵w-抗原，后變?yōu)榭贵w-抗原-酶聯(lián)抗體，待測的抗原處于兩個(gè)抗體之間，所以也稱為雙抗夾心法。

雙抗夾心法有一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：待檢測的物質(zhì)（如抗原）必須給包被抗體和酶聯(lián)抗體提供兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，這兩個(gè)位點(diǎn)可以是抗原上兩個(gè)以上相同的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)，也可以是不同的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)。

一般來說，Elisa的構(gòu)架由標(biāo)準(zhǔn)品，內(nèi)控品，對照，基質(zhì)對照和待測樣品組成。

 標(biāo)準(zhǔn)品 

根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體應(yīng)用方向來源，標(biāo)準(zhǔn)品可以是已知濃度的/國家標(biāo)準(zhǔn)品或者商業(yè)化的已知濃度的蛋白分子，也可以是自制的以其他方式定量（如紫外吸收定量）的純度較高的蛋白分子。標(biāo)準(zhǔn)品一般為7-8個(gè)濃度點(diǎn)，擬合成合適的濃度-信號(hào)劑量曲線作為標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行內(nèi)控品和樣品的定量。

 內(nèi)控品 

其中，內(nèi)控品是能夠使用的、獨(dú)立分裝的、特定濃度（高中低）的標(biāo)準(zhǔn)品，是監(jiān)控ELISA實(shí)驗(yàn)在單次實(shí)驗(yàn)中的質(zhì)量和的應(yīng)用過程中不同批次標(biāo)準(zhǔn)品的過渡橋接。

 對照 

對照為不含標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，基質(zhì)對照則為不含樣品的樣品溶液——兩者可能是一樣的成分，也可能是不同的成分，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體情況進(jìn)行區(qū)分，目的是確認(rèn)ELISA體系中是否有非異的交叉反應(yīng)。

三、ELISA實(shí)驗(yàn)：你的耗材試劑選對了嗎？

成功的ELISA方法的開發(fā)關(guān)鍵，在于對ELISA實(shí)驗(yàn)中所使用的試劑耗材的選擇和搭配。

對試劑耗材的特性和多樣性的了解，有助于在不同的實(shí)驗(yàn)需求中尋找合適的組合搭配中開發(fā)高質(zhì)量的ELISA方法。

①酶標(biāo)板材：

市面上提供的酶標(biāo)板材基本都是多聚苯乙烯，產(chǎn)品線比較齊全的公司會(huì)對多聚苯乙烯材質(zhì)的多種化學(xué)修飾以相對于包被的蛋白具有不同的特性。

一般的酶標(biāo)板材的說明書上會(huì)根據(jù)高結(jié)合力（Highbinding），中結(jié)合力（mediumbinding）的維度進(jìn)行劃分。

但筆者以多年的從業(yè)經(jīng)驗(yàn)出發(fā)，會(huì)更信任以親水，弱親水，未處理和疏水四個(gè)等級(jí)劃分酶標(biāo)板材的類型和特性的酶標(biāo)板材。

一般來說，酶標(biāo)板材由親水到疏水，對蛋白的結(jié)合會(huì)由強(qiáng)逐漸變?nèi)?，這會(huì)帶來三個(gè)效果：

相同濃度的蛋白包被，結(jié)合能力強(qiáng)的比結(jié)合能力弱的材料可以在酶標(biāo)板材上固定更多的蛋白，因?yàn)閱慰子H水板材的吸附抗體量是220ng，而疏水板材只有100ng。

由親水到疏水，板材對包被蛋白的吸附效率提高的同時(shí)，其對ELISA反應(yīng)過程中樣品蛋白、樣品溶液中的其他蛋白和酶聯(lián)抗體的非特異吸附的能力也會(huì)提高，從而造成非特異信號(hào)。

包被的蛋白作為一個(gè)大分子以一個(gè)表面吸附在酶標(biāo)板材上，其表面在不同酶標(biāo)板材上并不是大多數(shù)人想象中的隨機(jī)均勻的，有明顯的偏向性，會(huì)導(dǎo)致在不同的特性酶標(biāo)板材上，包被蛋白與酶標(biāo)板材的接觸表面不一樣，從而造成不同的位點(diǎn)被屏蔽的現(xiàn)象。如果這個(gè)位點(diǎn)恰好是與檢測樣品結(jié)合的位點(diǎn)，樣品將會(huì)因此無法被檢測到。

所以一個(gè)專注多樣化ELISA方法開發(fā)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該準(zhǔn)備多種不同特性的酶標(biāo)板材以供選擇。

②包被液：

常用的包被液是PBS（pH 7.4）或者碳酸鈉-碳酸氫鈉溶液pH 9.6，pH和離子濃度會(huì)對包被的效率產(chǎn)生一定的影響，需根據(jù)包被蛋白的特性進(jìn)行具體分析，包被蛋白溶液經(jīng)過包被后也不會(huì)都吸附在酶標(biāo)板材上，包被完成后大部分蛋白還是留在溶液中。

文獻(xiàn)中有記載蛋白溶于包被液后抽真空使包被蛋白以更高的密度吸附在酶標(biāo)板材上的案例。

③封閉劑：常用的封閉劑有3%BSA（w/v），5%脫脂奶粉（w/v）等。

封閉液的作用是覆蓋酶標(biāo)板材包被蛋白占據(jù)位置以外的空間，以抵抗后續(xù)樣品或者樣品中的其他物質(zhì)、酶聯(lián)抗體等對于板材直接的非特異吸附。

根據(jù)筆者多年的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，封閉劑只能對成分簡單的樣品溶液起到較好的封閉作用但面對成分比較復(fù)雜的樣品溶液，封閉效果則會(huì)大打折扣。

有研究表明，封閉劑的封閉效果和封閉分子的大小成反比，所以如果傳統(tǒng)的封閉劑起不到很好的封閉效果，選用分子量更小的封閉劑（如：酪蛋白），可能會(huì)取得更好的封閉效果。

另外需特別注意：如果檢測體系是生物素-鏈霉親和素體系，千萬不要使用脫脂奶粉作為封閉劑——因?yàn)槊撝谭壑泻猩锼兀瑫?huì)對檢測體系造成干擾。

④洗滌液/稀釋液：

常用的洗滌液是中性的緩沖液加上一定濃度的去污劑如PBST (0.05%(V/V) Tween-20 in PBS)。

稀釋液會(huì)在洗滌液中加入一定的封閉劑成分如0.5%BSA (W/V ) in PBST。

在一些體內(nèi)樣品的檢測過程中，通常會(huì)在稀釋液中加入一定濃度的陰性血清，以使得不同稀釋度的樣品有相同的非特異背景。

⑤酶聯(lián)抗體：

酶聯(lián)抗體的種類很多，可根據(jù)抗體的作用位點(diǎn)分為特異性酶聯(lián)抗體和通用型酶聯(lián)抗體。

特異性酶聯(lián)抗體作用于特定蛋白的表位上。

通用型酶聯(lián)抗體則往往針對于多肽序列組成的標(biāo)簽，生物素，特定種屬抗體的Fc端保守區(qū)域等。

常用的酶聯(lián)抗體標(biāo)記的酶主要為AP（堿性磷酸酶）和HRP（辣根過氧化氫酶）。

酶聯(lián)抗體根據(jù)其抗體的成分可分為單抗酶聯(lián)抗體和多抗酶聯(lián)抗體。

其中多抗酶聯(lián)抗體的多抗成分一般是通過免疫兔或者山羊得到的，成分比較復(fù)雜，需格外注意其與ELISA體系中其他試劑的交叉反應(yīng)。

酶聯(lián)抗體根據(jù)其抗體的分子量由大到小可分為全長的酶聯(lián)抗體、Fab片段酶聯(lián)抗體、scFv酶聯(lián)抗體。

分子量越小的酶聯(lián)抗體越有可能避免和樣品蛋白結(jié)合時(shí)可能存在的作用位點(diǎn)被空間阻礙的情況，但也進(jìn)一步增加了酶聯(lián)抗體繞過封閉劑的阻斷與酶標(biāo)板材進(jìn)行非特異結(jié)合的風(fēng)險(xiǎn)。

⑥顯色液和酶標(biāo)儀：

顯色液的選擇需與酶聯(lián)抗體的酶對應(yīng)，也需和實(shí)驗(yàn)室所具備的酶標(biāo)儀對應(yīng)。

如酶聯(lián)抗體偶聯(lián)的是HRP（辣根過氧化氫酶），可以采用TMB顯色液，用能夠進(jìn)行吸光度讀數(shù)的酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測；

或者Ampliflu™Red為底物，用能夠進(jìn)行熒光讀數(shù)的酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測；亦或采用QuantaRedADHP為底物，用能夠進(jìn)行化學(xué)發(fā)光讀數(shù)的酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。

一般來說，ELISA方法的靈敏度會(huì)受到底物的檢測方法限制，化學(xué)發(fā)光底物能夠檢測的信號(hào)下限要優(yōu)于熒光底物，再優(yōu)于吸光度值底物。

即使是常用的TMB顯色液，很多供應(yīng)商不同顯色強(qiáng)度的顯色液，可以根據(jù)方法開發(fā)過程的具體情況合理選擇顯色液。

四、ELISA定量方法學(xué)開發(fā)實(shí)際案例分析

布局

布局說明

增加了未包被（灰色）的分組，此分組是很有必要的，目的是為了確認(rèn)待檢測的樣品或者對照品物質(zhì)對酶標(biāo)板材的非特異吸附。

樣品進(jìn)行低中高稀釋，用來檢測樣品相對于對照品的平行性，即樣品和對照品在相同的ELISA體系中是否具備相同的免疫學(xué)特性。

如果低中高樣品的信號(hào)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線合理的定量范圍內(nèi)，低中高樣品經(jīng)稀釋倍數(shù)校正后的三組濃度值接近，說明樣品和對照品平行性較好，平行性較差則該樣品的檢測不能用該對照品作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

一般操作流程

01

酶標(biāo)板的制備：取濃度為100 ug/ml抗體，室溫溶解，混勻用包被液按如下步驟稀釋至5ug/ml，按加樣布局表加入100ml/孔，分別加入酶標(biāo)板條中 (Note 1)，其中加入包被液做包被抗體的對照，2-8℃過夜。

02

用洗滌液洗板3次，拍干，加入300ml/孔封閉液(Note 2)室溫封閉1小時(shí)；洗滌液洗板3次，拍干待用；

03

抗體對照品的梯度稀釋和樣品的高中低稀釋（Note 3），100ul/孔加入微孔板中標(biāo)準(zhǔn)品稀釋。

04

放入奧豪斯微孔板振蕩器內(nèi)，設(shè)置37℃、600rpm振蕩1小時(shí)；

05

用洗滌液洗板3次，拍干；

06

酶聯(lián)抗體稀釋到合適的濃度（Note 4），在奧豪斯漩渦混合器上混勻，100ul/孔。

07

放入微孔板振蕩器內(nèi)，設(shè)置37℃、600rpm振蕩1小時(shí)；    

08

用洗滌液洗板4次，拍干；

09

取酶聯(lián)抗體對應(yīng)的顯色液，臨用前20分鐘拿出平衡到室溫，在漩渦混合器上混勻；

10

使用8道排槍以100 ml/孔加入顯色液；

11

顯色液室溫避光放置10-30分鐘（Note 5）

12

使用8道排槍以100ml/孔加入終止液終止反應(yīng)；（根據(jù)底物的不同，此步可能不需要）

13

用酶標(biāo)儀測定信號(hào)值；（Note 6）

14

結(jié)果分析（Note 7）

貼心的Note說明-經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

Note1：在包被過程中如果需要減少整個(gè)ELISA體系試劑對酶標(biāo)板材的非特異吸附，建議選擇疏水性酶標(biāo)板材（polysorp）,包被的抗體濃度要足量2-5ug/ul。

Note2：封閉液不一定能起到封閉效果，需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（未包被抗原的分組），一般來講分子量越小的封閉劑效果越佳。

Note3：在方法學(xué)開發(fā)的初期可以拉大一下標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍1000ng/ml-0.1ng/ml。

Note4：酶聯(lián)抗體的稀釋需要做不同的稀釋度進(jìn)行比較選擇，對于單抗成分的酶聯(lián)抗體如果高低兩個(gè)稀釋度的酶聯(lián)抗體能夠產(chǎn)生一樣的劑量曲線，說明酶聯(lián)抗體過量，ELISA的信號(hào)傳遞未產(chǎn)生偏差。對于多抗成分的酶聯(lián)抗體，其稀釋度的判斷較為復(fù)雜，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度時(shí)的回測來判斷酶聯(lián)抗體濃度是否合適，如果對照品較高濃度的兩個(gè)點(diǎn)信號(hào)值接近，說明多抗酶聯(lián)抗體的濃度過低。

Note 5：對于吸光度值底物和熒光底物，儀器檢測的信號(hào)值和顯色時(shí)間成正比，控制在10-30分鐘為宜。需要提前確認(rèn)檢測儀器的信號(hào)線性范圍，比如一般的酶標(biāo)儀吸光度值的信號(hào)線性范圍在0-3，吸光度值在3-4之間為非線性的，在顯色時(shí)應(yīng)控制信號(hào)值不要超過3，或者將信號(hào)值大于3的點(diǎn)不列入標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合。

Note 6：不同底物需要用不同的儀器進(jìn)行檢測，吸光度讀值，熒光讀值，化學(xué)發(fā)光讀值。在底物選擇過程中注意實(shí)驗(yàn)室的酶標(biāo)儀是否具備該種類型的讀數(shù)功能。

Note 7：標(biāo)準(zhǔn)曲線的劑量曲線擬合可以是線性的，對數(shù)線性或者四參數(shù)擬合，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)是標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度點(diǎn)的回測偏差小于20%，如果不符合，刪除濃度點(diǎn)，直至符合標(biāo)準(zhǔn)。

五、總結(jié)

儀器的檢測信號(hào)的線性范圍是有限的，如TMB顯色液的信號(hào)的線性范圍在0-3，ELISA方法開發(fā)和優(yōu)化過程更多時(shí)候是對于對照品的信號(hào)值的控制和調(diào)整，以使得信號(hào)值在線性范圍內(nèi)。

使用增強(qiáng)型的TMB顯色，延長顯色時(shí)間，增加標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度點(diǎn)，增加酶聯(lián)抗體的濃度等增強(qiáng)信號(hào)值，反之能夠降低信號(hào)值。

在信號(hào)值的線性范圍有限的情況下，盡可能的消除非特異吸附的信號(hào)值是方法靈敏的關(guān)鍵之一，選用疏水性酶標(biāo)板材，采用分子量更小的封閉劑，采用相對簡單單抗酶聯(lián)抗體或者鏈霉親和素酶聯(lián)抗體等都是有效消除非特異吸附信號(hào)的形式。

在ELISA方法學(xué)開發(fā)過程中多樣化的試劑耗材的合理選擇和搭配是一個(gè)穩(wěn)定，靈敏的ELISA方法的關(guān)鍵，而多樣化試劑材料的特性的了解是選擇的關(guān)鍵，這個(gè)需要在對比實(shí)驗(yàn)中根據(jù)信號(hào)的變化系統(tǒng)的去了解和剖析。

 - 參考資料 - 

1. ELISA技術(shù)應(yīng)用概覽和方法學(xué)開發(fā)初析

有助于宏觀把握ELISA定量方法開發(fā)的原理

2. Decker J , Reischl U , Butler J E . SolidSupports in Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Other Solid-PhaseImmunoassays[M]// Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. Humana Press,2004.

非常有用的ELISA綜述，有利于了解ELISA的各個(gè)環(huán)節(jié)。

3. Desilva B , Smith W , Weiner R , et al. Recommendations forthe Bioanalytical Method Validation of Ligand-Binding Assays to SupportPharmacokinetic Assessments of Macromolecules[J]. Pharmaceutical Research(Dordrecht), 2003, 20(11):1885-1900.

ELISA定量方法系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證過程介紹，有助于對ELISA方法的優(yōu)劣進(jìn)行評估

4.  Findlay J W A , Dillard R F . Appropriate calibration curvefitting in ligand binding assays[J]. Aaps Journal, 2007, 9(2):E260-E267.

ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線不同函數(shù)進(jìn)行擬合的比較文章。

5. Cox K L , Devanarayan V , Kriauciunas A , et al. ImmunoassayMethods[J]. 2012.

類似此篇文章的英文實(shí)驗(yàn)手冊，可以借鑒學(xué)習(xí)下。

6. Pillutla R C . Book review: ligand-binding assays:development, validation and implementation in the drug development arena.[J].Bioanalysis, 2011, 3(3):271-273.

非常有用關(guān)于ELISA定量方法（ligand-binding assay）各個(gè)方面的書籍，有利于加深學(xué)習(xí)。