本文轉(zhuǎn)載自“科技日報”。

定位并切斷DNA上的基因位點，關閉某個基因或引入新的基因片段，讓失去希望的病人重獲治愈的可能……CRISPR基因編輯技術，自問世以來就被譽為“上帝的手術刀”。

但是，這個神奇的“手術刀”也有失手的時候，其脫靶效應一直是阻礙其應用的關鍵障礙之一。

近日，由來自南京大學、廈門大學和南京工業(yè)大學的科研人員，開發(fā)出一種“基因剪刀”工具的新型載體，可實現(xiàn)基因編輯可控，在癌癥等重大疾病治療方面具有廣闊的應用前景。目前，該成果已在新一期美國《科學進展》雜志上發(fā)表。

來自病毒載體的擔憂

轉(zhuǎn)基因大豆油、抗蟲棉花、甚至是免疫艾滋病的基因編輯嬰兒……雖然爭論不休，但在短短數(shù)十年時間里，基因編輯技術作為一個新時代的產(chǎn)物，還是迅速地跟多數(shù)普通人建立起聯(lián)系。但是，說到其中運用的工具和原理，很多人就不太熟悉了。

自上世紀60年代揭示遺傳密碼的秘密之后，人類對基因的改造嘗試就從未停止過。用更形象的說法，基因編輯可以理解為，利用“基因剪刀”將DNA鏈條斷開，對目標DNA片段進行改造的過程，無論是增添還是敲除基因，本質(zhì)上都是從分子水平改變生物的性狀。

目前，科學家們普遍使用的“基因剪刀”是一種名為CRISPR-Cas9的外源DNA，它的誕生離不開細菌。病毒為了自身繁衍利用細菌的細胞工具為自己的基因復制服務，細菌在與病毒抗爭的過程中，在體內(nèi)進化出CRISPR系統(tǒng)，能夠不露聲色地將病毒基因從自己的染色體上切除。科學家們正是利用了這一特性，開發(fā)出了這款的“基因剪刀”。

如何把CRISPR-Cas9送到細胞中去？這就需要借助到載體的幫助。

根據(jù)基因載體來源，我們可以把基因載體分成5大類，分別是質(zhì)粒載體、噬菌體載體、病毒載體、非病毒載體和微環(huán)DNA。其中病毒載體是目前普遍的遞送方式，截至2018年6月，臨床試驗中超過70%的基因藥物載體為病毒。將復合物連接到病毒后，病毒侵入靶細胞的細胞核，CRISPR-Cas9這把“基因剪刀”才能發(fā)揮出真正的功能。

逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關病毒（AAV），這三大類病毒，已經(jīng)在提供遺傳物質(zhì)的治療方面進行了廣泛的應用。然而，構建病毒載體是一個艱苦而且高成本的過程，并且運用這些病毒載體遞送并不能做到*。“CRISPR-Cas9的優(yōu)勢很明顯，劣勢也明顯。它存在脫靶效應，也可能會切斷目標之外的其他區(qū)域，對正常的區(qū)域進行切除時，就會產(chǎn)生很大的損傷。”南京大學現(xiàn)代工程與應用科學學院教授宋玉君說。

研究表明，病毒類載體在CRISPR-Cas9系統(tǒng)中存在著固有缺點，包括致癌風險，插入大小限制以及會在人體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒可能造成插入性突變，導致癌癥發(fā)生，向靜脈高劑量注射AAV用于基因治療也會產(chǎn)生嚴重毒性。

更安全的基因編輯載體來了

病毒作為運輸載體用于基因工程的安全性還不能*掌控，因此科學家們提出了幾種替代的非病毒遞送材料，包括金納米顆粒、黑磷、金屬有機骨架、氧化石墨烯和各種納米材料。

相比病毒，這些材料在安全性上有了很大的提升。但是，基因編輯的時間和基因編輯的過程，仍然無法為科學家所控制。

發(fā)表在《科學進展》雜志上的科研成果中，來自南京大學、廈門大學和南京工業(yè)大學的科研人員開發(fā)出一種“基因剪刀”工具的新型非病毒載體，可以通過近紅外光控制“修剪”基因的方式，實現(xiàn)體內(nèi)時間和空間上的基因編輯可控，在癌癥等重大疾病治療方面具有廣闊的應用前景。

針對CRISPR-Cas9的脫靶效應，研發(fā)團隊經(jīng)過長達一年半的試驗，研發(fā)出一種名叫“上轉(zhuǎn)換納米粒子”的非病毒載體，這種納米粒子可以被細胞大量內(nèi)吞，通過一種光敏化合物將CRISPR-Cas9鎖定在上轉(zhuǎn)換納米粒子上。

宋玉君表示：“紅外光具有強大的組織穿透性，這為在人體深層組織中安全、地應用基因編輯技術提供了可能。”

實驗的觸發(fā)裝置就在于兩種光——近紅外光和紫外光。近紅外光和紫外光具有特殊的性質(zhì)，前者可以穿透人體組織到達目標位置，后者則可以實現(xiàn)切斷光敏分子。暴露在近紅外光下，這些納米粒子吸收低能近紅外輻射并將其轉(zhuǎn)化為可見的紫外光，能夠自動打開納米粒子和Cas9蛋白之間的“鎖”，使Cas9蛋白進入細胞核，從而實現(xiàn)對靶點基因敲除，誘發(fā)腫瘤細胞凋亡。

該團隊從基因、蛋白及細胞等多個角度對該體系的有效性進行了驗證，在對荷瘤小鼠進行治療的過程中團隊發(fā)現(xiàn)，只有近紅外光照射實驗組的腫瘤得到了有效抑制，且從20天后取下的腫瘤大小來看，實驗組腫瘤遠遠小于對照組。

該技術為非病毒載體在基因工程上的運用打開了另一扇門。一旦未來這項技術能夠?qū)崿F(xiàn)臨床，腫瘤尤其是實體瘤就能實現(xiàn)無創(chuàng)治療，帕金森癥、糖尿病等患者也能從這項技術中受益。

非病毒載體未來*

病毒載體雖然在臨床中廣泛使用，但其安全不確定性、高昂的制備及運輸費用制約著其在基因工程中的推廣前進。因此，非病毒載體越來越引起研究者的注意。

“目前，各種納米材料的非病毒載體都有科研人員在做，比如可降解的生物高分子材料，它的前景是非常大的。”宋玉君告訴記者。

關于非病毒載體的研究有兩個方向，一個是有機材料基因遞送體系，另一個是無極材料基因遞送體系。在有機材料研究領域中，脂質(zhì)體、聚乙烯亞胺及其衍生物、陽離子多肽、樹形分子及其衍生物、殼聚糖及其衍生物、聚氨基酯、環(huán)糊精及其衍生物為科學家研究的主要方向。

各類脂質(zhì)體設計的非病毒脂質(zhì)納米粒子易于制備，免疫反應不劇烈，而且有更大的有效荷載，因此已經(jīng)在臨床中被廣泛運用，如疫苗和基因藥物遞送、癌癥治療、腫瘤影像學等都會使用這種遞質(zhì)。以聚乙烯亞胺及其衍生物為載體的遞送系統(tǒng)也已經(jīng)運用在多重疾病的臨床試驗中，包括卵巢癌、胰腺癌、原發(fā)性腹膜惡性腫瘤、多發(fā)性骨髓瘤等。而其他的遞質(zhì)材料的研究基本沒有進入臨床階段。

相比于有機材料，無機材料則更容易人為控制，它的尺寸可調(diào)，表面也容易修飾。金納米粒、碳納米管、石墨烯、上轉(zhuǎn)換納米粒等材料均有廣泛研究，主流的遞送方式包括將負電基因與正電無機納米粒形成復合物、將基因以響應性共價鍵形式連接在納米粒上或者在無機納米粒表面修飾兩親性高分子，負電荷基因通過靜電作用吸附在高分子層中。宋玉君所在團隊研發(fā)的光操縱基因編輯新技術還是次。

目前，無機遞送材料的研究還停留在實驗室階段，臨床階段的試驗尚未批準，關于它對機體的影響還沒有確切的定論。

“無機納米粒子含有人體非必須的元素，因此可能會產(chǎn)生一些副作用。我們在實驗時，對小鼠層面觀察時間比較短，少至幾周多則幾個月，在細胞層面和動物層面還沒有發(fā)現(xiàn)大的影響。如果能夠找到合適、安全、具有相同功能的無機材料，它的前景將會*。”宋玉君對非病毒載體的未來充滿信心。