上期小奧課堂和大家講了《ELISA方法學(xué)開發(fā)實踐版-生物大分子檢測的定量方法開發(fā)》。
本期小奧再和大家分享另一個重要話題：《ELISA方法學(xué)開發(fā)實踐版-親和力測定方法開發(fā)》。

一、前言

目前用于測定受體配體間的親和力，也就是解離平衡常數(shù)的方法，主要有：

1. 熱力學(xué)測定方法
2. 動力學(xué)測定方法
3. 飽和濃度法

其中動力學(xué)測定方法和飽和濃度法較為通用：動力學(xué)測定方法（如Biacore）涉及到比較昂貴的儀器投入，飽和濃度測定法為國內(nèi)絕大多數(shù)生物藥物企業(yè)常用的測定方法。

ELISA用于親和力的測定是飽和濃度測定法的主流模式，常用于抗原蛋白或者抗體的蛋白水平的活性評估和抗體的穩(wěn)定性評價等。
ELISA用于親和力測定往往沒有商業(yè)化的試劑盒，需要實驗人員進行方法學(xué)開發(fā)。

由于生物技術(shù)這方面教育缺失和新藥研發(fā)企業(yè)在此應(yīng)用的積累不夠，一個能夠通過方法學(xué)驗證的ELISA親和力測定方法對于很多從業(yè)人員來說是一件難度較大的事情，而且很有可能出現(xiàn)謬誤如新號傳遞錯誤或者偏差等。
其中的一個謬用是采取ELISA定量的實驗條件進行ELISA親和力測定方法的開發(fā)。

本文從親和力的測定方法的基本原理入手，描述飽和濃度法親和力測定的基本原則，概述ELISA方法開發(fā)過程中的抗原抗體的劑量關(guān)系，以及在ELISA用于親和力測定方法應(yīng)用時可能會出現(xiàn)的幾個錯誤，并為大家介紹通用的親和力測定的方案和初步的方法學(xué)開發(fā)的方案。

二、親和力基本概念

我們通過分析幾個化學(xué)反應(yīng)案例，和大家解釋一下什么叫做親和力。

 例子A 
氫氣和氧氣在點燃的條件下生成水。
在反應(yīng)停止時，如果在反應(yīng)環(huán)境中氫氣的摩爾濃度恰巧是氧氣的摩爾濃度的2倍時，兩者皆被消耗，反應(yīng)環(huán)境中只有水；如果氫氣的摩爾濃度大于氧氣的摩爾濃度的2倍時，氧氣被消耗，反應(yīng)環(huán)境中只有氫氣和水；果氫氣的摩爾濃度小于氧氣的摩爾濃度的2倍時，氫氣被消耗，反應(yīng)環(huán)境中只有氧氣和水。
這是關(guān)于化學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)知識，化學(xué)反應(yīng)進行的結(jié)果，反應(yīng)物能夠變?yōu)樯晌铮捶磻?yīng)能進行到底，有此類反應(yīng)的過程和結(jié)果特性的反應(yīng)稱之為不可逆反應(yīng)。

 例子B 
PD1抗原（CD279）和PD1抗體（如pembrolizumab）在常溫常壓下反應(yīng)。
在反應(yīng)停止時，如果反應(yīng)環(huán)境中CD279的摩爾濃度為200nM, pembrolizumab的摩爾濃度是100nM時，在理想條件下pembrolizumab-CD279復(fù)合物的濃度為97.86nM, CD279的摩爾濃度為4.28nM, pembrolizumab為2.14nM; 
如果反應(yīng)環(huán)境中CD279的摩爾濃度為100nM, pembrolizumab的摩爾濃度是200nM時，在理想條件下pembrolizumab-CD279復(fù)合物的濃度為49.81nM, CD279的摩爾濃度為0.38nM, pembrolizumab為159.19nM。

 例子C 
PD1抗原（CD279）和PDL1抗原（CD274）在常溫常壓下反應(yīng)。
如果反應(yīng)環(huán)境中CD279的摩爾濃度為200nM, CD274的摩爾濃度是100nM時，在反應(yīng)完成時理想條件下CD274-CD279復(fù)合物的濃度為2.35nM, CD279的摩爾濃度為197.65nM，CD274的摩爾濃度是97.65nM；
如果反應(yīng)環(huán)境中CD279的摩爾濃度為100nM, CD274的摩爾濃度是200nM時，在反應(yīng)完成時理想條件下CD274-CD279復(fù)合物的濃度為2.35nM, CD279的摩爾濃度為97.65nM，CD274的摩爾濃度是197.65nM，絕大多數(shù)CD279和CD274并未參與反應(yīng)。
案例B、C兩種情況下，無論是抗原和抗體（配體和受體）結(jié)合反應(yīng)，兩者反應(yīng)有生成復(fù)合物的正反應(yīng)過程，也有復(fù)合物解離反應(yīng)生成抗原、抗體逆反應(yīng)過程，終的結(jié)果是抗原，抗體和抗原-抗體復(fù)合物三者共存的狀態(tài)。

這樣的反應(yīng)稱之為可逆反應(yīng)。
當(dāng)一個可逆反應(yīng)中正反應(yīng)和逆反應(yīng)的速度相等時，反應(yīng)體系中抗原的濃度、抗體的濃度和抗原-抗體復(fù)合物濃度不再增加也不再減少，可逆反應(yīng)完成，反應(yīng)體系中各成分摩爾濃度處于動態(tài)平衡。

親和力(Affinity)是可逆反應(yīng)過程中抗原、抗體和抗原-抗體復(fù)合物之間的相對狀態(tài)的特征參數(shù)，其更加專業(yè)性和術(shù)語化的名稱是解離平衡常數(shù)KD，單位mol/L(和濃度單位一致)。

親和力數(shù)值越小則親和力越強，親和力的強弱決定了終決定反應(yīng)完成時可逆反應(yīng)各組分相對多少。

如例子B和C同樣是和200nM CD279（PD1）反應(yīng)，抗體pembrolizumab (PD1抗體)相對于CD279的親和力為0.4nM, 配體CD274（PDL1）相對于CD279的親和力為8200 nM,終反應(yīng)生成的pembrolizumab-CD279復(fù)合物是97.86 nM,而CD274- CD279復(fù)合物僅僅只有2.35nM，兩者相差42倍。

有別于不可逆反應(yīng)，除了抗原抗體的摩爾濃度外，抗原和抗體（配體和受體）兩者間的親和力將極大的影響可逆反應(yīng)中生成物的多少。

三、你知道ELISA進行方法學(xué)開發(fā)時的基本原則嗎？

對于親和力測定方法和原理的概述，讀者可參考生物功能學(xué)篩選評價技術(shù)之親和力評價篇。
本文主要對飽和濃度法進行概括。
R代表受體或抗原，L代表配體或抗體。
采用飽和濃度法，如果要測定配體相對于受體的親和力，少量R存在的情況下，將L進行梯度稀釋，檢測R-L復(fù)合物的濃度，當(dāng)R-L復(fù)合物的濃度占總R濃度的一半時，L對應(yīng)的濃度值（EC50）即L相對于R的KD值。
RL復(fù)合物/R即B值可用檢測的信號值代替，梯度稀釋的L和信號之間的函數(shù)關(guān)系滿足下面的公式，只有在此在特定的實驗條件下EC50值能夠等價于KD值。
飽和濃度法測定KD值有幾個關(guān)鍵點，即相互作用的兩個分子，R要少量，L要進行連續(xù)的梯度稀釋，需要得到的信號響應(yīng)值（所有的R的結(jié)合位點被L占據(jù)）即平臺期，那么在此條件下，占據(jù)一半R時，所需要的L濃度（EC50）為KD值。
飽和濃度法主要測定的是代表RL復(fù)合物的信號值，測定方法可以是流式細胞術(shù)、同位素標(biāo)記術(shù)、熒光偏振，也可以是ELISA。

四、用于親和力測定的ELISA方法學(xué)開發(fā)常用方法

布局

一般操作流程

01 酶標(biāo)板的制備：取濃度為100 ug/ml抗原，室溫溶解，混勻用包被液按如下步驟稀釋至0.2ug/ml，0.5ug/ml，1ug/ml，按加樣布局表加入100ul/孔，分別加入酶標(biāo)板條中(Note 1)，其中加入包被液做包被抗體的對照，2-8℃過夜；
02用洗滌液洗板3次，拍干，加入300ul/孔封閉液(Note 2)室溫封閉1小時；洗滌液洗板3次，拍干待用；
03 按照布局將抗體以100000ng/ml起始3倍梯度稀釋（Note 3），按照布局，100ul/孔加入微孔板中；
04放入奧豪斯微孔板振蕩器 (ISLDMPHDG)內(nèi)，設(shè)置37℃、600rpm振蕩1小時；  

05用洗滌液洗板3次，拍干；
06酶聯(lián)抗體稀釋到合適的濃度（Note 4），在奧豪斯渦旋儀（VXMNFS）上混勻，100ul/孔；

07放入微孔板振蕩器內(nèi)，設(shè)置37℃、600rpm振蕩1小時；    
08用洗滌液洗板4次，拍干；
09取酶聯(lián)抗體對應(yīng)的顯色液，臨用前20分鐘拿出平衡到室溫，在漩渦混合器上混勻；
10使用8道排槍以100 ul/孔加入顯色液；
11顯色液室溫避光放置10-30分鐘 （Note 5）；
12使用8道排槍以100 ul /孔加入終止液終止反應(yīng)（根據(jù)底物的不同，此步驟可能不需要）；
13用酶標(biāo)儀測定信號值（Note 6）；
14結(jié)果分析（Note 7）。 

貼心小NOTE

Note1：如果需要減少反應(yīng)過程中高濃度的抗體（100000ng/ml）對酶標(biāo)板材的非特異吸附，在包被過程中，建議選擇疏水性酶標(biāo)板材（polysorp）,包被的抗原濃度需要少量0.2-1ug/ml，具體情況需要根據(jù)抗原抗體的親和力大小來進行判斷優(yōu)化。一般來說親和力越強，所需的抗原包被濃度越低。
Note2：封閉液不一定能起到封閉效果，需要實驗驗證（未包被抗原的分組），一般來講分子量越小的封閉劑效果越佳。
Note3：在方法學(xué)開發(fā)的初期可以拉大一下標(biāo)準曲線的濃度范圍100000ng/ml-0.1ng/ml，以得到有明顯上下平臺期的全曲線，當(dāng)抗原抗體間親和力較強時，梯度濃度可縮小，稀釋的倍數(shù)可在方法學(xué)優(yōu)化過程中縮小至2倍。
Note4：酶聯(lián)抗體效應(yīng)過量，酶聯(lián)抗體的稀釋需要做不同的稀釋度進行比較選擇，對于單抗成分的酶聯(lián)抗體，如果高低兩個稀釋度的酶聯(lián)抗體能夠產(chǎn)生一樣的劑量曲線，說明酶聯(lián)抗體過量，ELISA的信號傳遞未產(chǎn)生偏差。
對于多抗成分的酶聯(lián)抗體，其稀釋度的判斷較為復(fù)雜，可以初略計算下酶聯(lián)抗體的摩爾濃度要高于包被上的抗原摩爾濃度的5倍以上。當(dāng)酶聯(lián)抗體濃度較小時，酶聯(lián)抗體在高劑量不同濃度的抗體條件下均被抓到，曲線有假上平臺。
Note5：對于吸光度值底物和熒光底物，儀器檢測的信號值和顯色時間成正比，控制在10-30分鐘為宜。需要提前確認檢測儀器的信號線性范圍，比如一般的酶標(biāo)儀吸光度值的信號線性范圍在0-3，吸光度值在3-4之間為非線性的，在顯色時應(yīng)控制信號值不要超過3，當(dāng)信號值超過線性范圍時，曲線有假上平臺。
Note6：不同底物需要用不同的儀器進行檢測，吸光度讀值，熒光讀值，化學(xué)發(fā)光讀值。在底物選擇過程中注意實驗室的酶標(biāo)儀是否具備該種類型的讀數(shù)功能。
Note7：標(biāo)準的劑量曲線擬合一般用四參數(shù)擬合，需要有明顯的上下平臺期（A，D值），斜率一般在0.8-1.2（B值）之間，EC50（C值）即為抗體相對于抗原的親和力值。

五、總結(jié)

根據(jù)飽和濃度法，采用ELISA進行親和力測定時，需要有明顯的四參數(shù)S型曲線，即需要有隨抗體濃度漸進變化的信號曲線。
在抗體低濃度和高濃度時有明顯的上下平臺期，上平期信號值的一半對應(yīng)的抗體濃度（EC50）值即抗原抗體間親和力KD值。
由于儀器的檢測信號的線性范圍是有限，當(dāng)信號超過線性范圍時會使曲線進入假上平臺期使得測得的親和力不準。
包被的抗原濃度直接決定了信號的信號值，所以在用ELISA進行親和力測定時，包被的抗原濃度盡量要小，以得到合適的信號值；酶聯(lián)抗體濃度過低時也可能使曲線進入假平臺期。

在ELISA方法學(xué)開發(fā)過程中，酶聯(lián)抗體過量以信號的線性傳遞需要經(jīng)過實驗驗證。
當(dāng)信號無法得到有效的上平臺期時，說明抗原抗體間的親和力太弱或者包被抗原過多，需要更大濃度的抗體才能使得所有抗原被抓住以達到平臺期。
受限于ELISA靈敏度的限制，在一些親和力較弱（>100nM）的抗體抗原中，采用ELISA方法基本得不到有效的平臺期，也無法測得的親和力數(shù)值。
ELISA進行親和力測定評價抗原的活性或者測定抗體活性時，得到的EC50并非越小越好，信號進入假平臺期（達到儀器的檢測極限，酶聯(lián)濃度較?。?/span>均會使EC50變小，從而得到錯誤的親和力數(shù)據(jù)，這也是ELISA進行親和力測定時容易產(chǎn)生的謬誤。
如今很多抗原蛋白的供應(yīng)商關(guān)于抗原活性的評價均存在此類謬誤。

抗原和抗體間的親和力是有兩者的結(jié)構(gòu)和相互作用決定的，可能是0.1 nM,1 nM或者1000 nM。評價ELISA親和力測定方法的好壞需要看此EC50值是否和親和力的值相符，親和力的值可通過熱力學(xué)測定方法，動力學(xué)測定方法和飽和濃度法中的細胞流式測定法等多方面驗證。
反過來說當(dāng)一個ELISA方法不存在諸如信號進入假平臺期（達到儀器的檢測極限，酶聯(lián)濃度較?。?/span>等謬誤時，其EC50值才能真實的反應(yīng)親和力的數(shù)值。

采用ELISA進行方法學(xué)開發(fā)需要明確應(yīng)用目的，大分子定量和親和力測定。
不同的應(yīng)用目的，抗原和抗體的相對劑量濃度會有很大的差異，有不同的劑量曲線，讀者可以結(jié)合上篇《ELISA方法學(xué)開發(fā)實踐版-生物大分子檢測的定量方法開發(fā)》進行對比研究，明晰差異。

本期分享就到這里啦，我們下期再會喲！

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