怎樣選擇液相色譜柱?

 

現(xiàn)代液相色譜中，分離效果好壞很大程度上取決于色譜填料的選擇。但

是色譜填料的選擇范圍很寬，要做合適的選擇，必須對此有一定的認識和了解。

 

1、正相色譜

正相色譜用的固定相通常為硅膠（Silica），以及其他具有極性官能團，如胺基團 

(NH2,APS)和氰基團（CN，CPS）的鍵合相填料。

   

由于硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其他團的極性較強，因此，分離的次序是依據樣品

中的各組份的極性大小，即極性強弱的組份zui先被沖洗出色譜柱。

正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低，如：正乙烷（Hexane）,氯仿

（Chloroform）,二氯甲烷（Methylene  Chloride）等。

2、反相色譜

反相色譜填料常是以硅膠為基礎，表面鍵合有極性相對較弱的官能團的鍵合相。

反相色譜所使用的流動相極性較強，通常為水，緩沖液與甲醇，已腈等混合物。

樣品流出色譜柱的順序是極性較強組合zui先被沖出，而極性弱的組份會在色譜柱上有

更強的保留。

常用的反相填料有C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（Phenyl）等。

 

二、聚合物填料

聚合物調料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要優(yōu)點是在PH值為1～

14均可使用。

相對與硅膠基質的C18填料，這類填料具有更強的疏水性；大孔的聚合物填料對蛋白

質等樣品的分離非常有效。

現(xiàn)在的聚合物填料的缺點是相對硅膠基質填料，色譜柱柱效較低。

 

三、其他無機填料

其它HPLC的無機填料色譜柱也已經商品化。由于其特殊的性質，一般于特殊的

用途。如石墨化碳也用于正逐漸成為反相色譜填料。這種填料的分離不同與硅膠基質烷基

鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎，不再需其它的表面改性，該柱填料一般比烷基

鍵合硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強，石墨化碳可用于分離某些幾何導構體，又由

于HPLC流動相中不會被溶解，這類柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可用于HPLC，

氧化鋁微粒剛性強，可制成穩(wěn)定的色譜柱柱床，其優(yōu)點是可在PH高達12的流動相中使用。

但由于氧化鋁與堿性化合物作用也很強，應用范圍受到一定的限制，所以未能廣泛應用，

新型氧化鋯填料也可用于HPLC，商品化的僅有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應

用PH范圍1～14，溫度可達100℃。由于氧化鋯填料幾年才開始研究，加之面臨的實驗難

度，其重要用途與優(yōu)勢尚在進行中。

 

 

怎樣選擇填料粒度

 

目前，商品化的色譜料粒度從1um到超過30um均有銷售，而目前分析分離主要用3um、

5um和10um填料，填料的粒度主要影響填充柱的兩個參數(shù)，即柱效和背壓。粒度越小，填

充柱的柱效越高；小于3um的填料應用，在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度，

但不是*的因素。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選擇更小粒度的填料

是很有用的，3um填料填充柱的柱數(shù)比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，

3um的色相譜的背壓卻是5um的2倍。與此同時，柱效提高意味著在相同條件下可以選擇更

短的色譜柱，以縮短分析時間，另外，可以采用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使

用溫度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色譜柱的壓力。

 

一、如何保證良好的柱性能與柱壽命

◆ 認證閱讀色譜柱使用說明書；

◆ 使用填充良好的色譜柱；

◆ 盡量減少壓力波動，避免機械及熱沖擊；

◆ 使用保護柱及在線過濾器；

◆ 經常以強溶劑沖洗色譜柱；

◆ 充分過濾樣品及流動相，盡量避免雜質微粒與強保留成分；

◆ 用穩(wěn)定的固定相（C18zui穩(wěn)定）；

◆ 在中等PH值操作（6~8），用有機緩沖溶液；

◆ 色譜柱使用溫度小于40℃；

◆ 硅膠基質的的色譜柱，應保持流動相的PH值范圍在3.0~8.0；

◆ 在水流動相與緩沖溶液中加200ppm的疊氮鈉；

◆ 流動相中含有緩沖溶液，應注意應95∶5的水及有機溶劑過渡，有機溶劑不能低于5%；

◆ 過夜或貯存時，沖洗掉鹽和緩沖液，用純有機溶劑流動相保存（乙晴）。

 

HPLC固定相及應用范圍

名稱    別名       功能基團   正相  反相  離子對  應用
 
Silica                      -OH            √                          非極性和中等極性以及非離子性有機化合物。
 
SAS    C1              -(CH3)3                √                 在所有的烷基鍵合相中對非極性化合物保留zui

                                        弱，典型用于中等極性和多官能團化合物.
 
Butyl   C4               -C4H9                  √     √        分離肽和蛋白質，保留時間比C8和C18短。
 
MOS   C8，          -C8H17                  √     √       中等極性相中對中等化合物，小肽和蛋白質，

           Octyl                                                            極性藥族化合物和環(huán)境樣品。
 
ODS   C18             -C18H37               √      √       烷基鍵合相中對中等極性化合物保留zui強。廣

                                        泛用于藥物，甾族化合物，脂肪酸和環(huán)境樣品.
 
CPS   CN ,Cyano   -(CH2)3CN      √     √           對極性化合物有*的選擇性，適合應用于正相

(propyl                                                        分離，當用于反相系統(tǒng)時，其選擇性與  C8和

Nitrile)                                                        C18不同，在藥學領域和復雜混合物的分離中應

                                 用廣泛。
 
APS   NH2             -(CH2)3 NH2     √     √          反相中分析糖類和其他極性化合物。弱陰離子交

         (Amino Propyl)                                               換 ，陰離子和有機酸則應用緩沖劑和有機改性

                                        劑 做流動相。正相中與硅膠的選擇性機改性劑

                                        不同,分析芳香族效果很好。
 
Phenyl                     -(CH3)C6H5              √     √  芳香族化合物
 
Diol                         -(CH2)2O       √     √       反相時，分離肽和蛋白質。正相時，與硅選擇

                               CH2(CH2OH)2                                 性 相似,但極性較弱。
 
SCX  強陽離子     -(CH2)2C6H4SO3H-             √  有機堿

交換
 
SAX  強陰離子     -(CH2)3N+(CH3)3　　　　　　  有機酸，核苷和核苷酸

交換
 

 

 

二、如何解決色譜柱使用過程中出現(xiàn)的問題

 

1.保留值與分離度重現(xiàn)性不好原因分析

 

問題                             原因                      表現(xiàn)
 
不同色譜柱間差異          填料、鍵合相不同            保留因子（k），分離因子（α）

使用期間柱變化              柱床破壞                             柱效（N）

                     鍵合相丟失                         保留因子（k），分離子（α）

                     硅膠基質溶解                     柱效（N）

                     強保留分堆積堵塞             保留因子（k），柱效（N）
 
柱外效應                          系統(tǒng)差異，進樣量大、   柱效（N）

                     進樣閥與   色譜柱之間、

                     色譜柱與檢測器之間管

                     路太長、檢測器流通池

                     體積大、接頭死體積大

                     等。
 
分離效果變差                  流動相組分改變                保留因子（k），柱效變化很小  

                     流速改變                            保留因子（k），分離因子（α）

                     溫度改變                            保留因子（k），柱效變化很小
 
柱平衡慢                         重新平衡時間不夠             保留因子（k），柱效變化很小
 
柱超載                             樣品量太大                         保留因子（k），柱效（N）
 

2.造成色譜峰（不對稱）拖尾的原因

 

1.色譜柱本身填裝問題，篩板堵塞或填料塌陷；

2.柱頭有污染；

3樣品超載；

4樣品溶劑不合適；

5.柱外效應；

6化學或二次保留（硅羥基）效應；

7緩沖容量不足或不合適；

8重金屬污染。

 

3.如何解決峰形拖尾的問題

 

A．與化學有關的拖尾問題

1．流動相中，加入30mM的三乙胺（用與堿性化合物）或醋酸胺（用與酸性化合物），未

知化合物加醋酸三乙胺；

2．如仍然拖尾，將三乙胺換為二甲基辛胺（或醋酸二甲基辛胺）；

3．降低進樣量至《1ug。

 

B．與色譜柱有關的拖尾問題

1．如柱頭處有強保留的樣品組分積聚，反相柱可用20倍柱體積的96%的二碌甲烷與4%甲

醇，加1%氫氧化銨混合液沖洗，正向柱可用甲醇沖洗。

2．使用保護柱

 

C．與HPLC 系統(tǒng)有關的峰拖尾和峰加寬

1．進樣體積過大，（通常≤25uL）；

2．進樣閥與色譜柱及檢測器之間的管路體積過大（*連接管應《20cm，內徑為0.007″）；

3．檢測器流通池的體積過大。

 

 

4．如何儲存色譜柱

 

1．防止緩沖溶液和水溶液流動相產生微生物，做到流動相用多少配多少，或在水流動相中加200ppm的疊氮鈉以抑制細菌成長（一定當心其毒性和潛在的爆炸性）；或在流動相中加20%的有機改性劑，也可抑制微生物生長，有機改性劑還有助于流動相脫氣。

2．盡可能將色譜柱貯存于100%有機溶劑（乙晴）中，避免在緩沖溶液中保存。

3．使用緩沖溶液后的色譜柱，應用15～20倍柱體積的不含緩沖劑的同種水—有機溶劑流動相沖洗色譜柱，后換成100%有機溶劑儲存。

4．避免用純凈水沖洗鍵合致密的C18柱。

5．將色譜柱的兩端用堵頭擰好，以免柱床填料干裂。

如何選擇保護柱

    怎樣選擇保護柱，但又不能影響分離分析？這是色譜工作者經常提出的一個問題。通常，在選擇保護柱之前首先要考慮的是樣品是否清潔。對于大部分分析工作者來說，一只1cm長的保護柱，那么就應選擇2cm或3cm長的保護柱。保護柱越長，自然所裝填的色譜填料就越多，則其越能避免污染物進入分析色譜柱的機會。當然，隨著保護柱的長度加長，樣品的保留時間會比使用短保護柱長。一般來說，保護柱的內徑與分析色譜柱的內徑相同或相當即可。保護柱的填料裝填方式也很重要。目前有薄膜裝填法的保護柱，使用過程很簡單方便，而且可以在實驗室中進行干裝。但是，其zui大的缺點是不經濟，特別是針對中國的具體情況，一次性使用相對費用較高。另外，薄膜裝填法的保護柱所裝填的色譜填料有限，只能提供有限的保護作用；不過也因為所裝填的色譜料較少，保護柱的長度也較短，所以對分析樣品的保留時間的影響也很小。另一種保護柱結構其實質是縮短了的色譜分析拄，設計方式上有直連式、手緊式或整體式。整體式設計是由色譜的生產廠商直接安裝在色譜分析柱上的，必須與色譜分析柱一同訂貨，可以非常方便地使用，但不能夠被修改。直連式結構設計可在任何時候有色譜工作者來安裝連接，可以與任何品牌的色譜分析柱連接使用，而且還可以根據樣品的相關情況選擇不同的保護柱長度。手上緊即可。另外從保護柱結構又分為是否可以更換保護柱柱芯。可以降低保護柱的使用成本。大多數(shù)人是根據色譜分析柱的填料選擇保護柱的填料，正常情況下可以選擇與分析色譜柱一樣的色譜填料。但是，根據實際的分析工作，也可不必與分析色譜柱的填料*相匹配。

對于選擇保護柱的原則是：在滿足分析分離要求的前提條件下，盡可能的選擇較短的保護柱結構，盡可能選擇對分離樣品小一些保留性的填料。