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關(guān)于層析柱裝柱、使用及相關(guān)注意事項(xiàng)
關(guān)于層析柱裝柱、使用及相關(guān)注意事項(xiàng)
（1）、裝柱前要仔細(xì)看填料的使用說(shuō)明書(shū)，每種填料都有自己的特性，以及特殊的裝柱方法，針對(duì)不同的空柱，也要注意方法可能不同；
3、這一點(diǎn)非常重要：裝柱包括以后使用中不允許柱內(nèi)進(jìn)入氣泡（bubble free），柱頭事先也要排除氣泡。
（2）、填料要加水?dāng)嚢璩删鶆驊乙?，懸液濃度依填料而不同，一?0－85%，迅速倒入空柱內(nèi)，或吸或壓，流速和具體步驟看說(shuō)明書(shū)。
（3）、所有柱子盡量做到填料均勻，尤其是用于凝膠層析的柱子。裝柱完成后，可用柱效測(cè)定的方法檢查裝填效果。一個(gè)裝填合格的柱子的理論塔板高度應(yīng)是填料平均粒徑的2－4 倍，在此范圍內(nèi)越小越好。
（4）、選擇合適的泵，**是流速滿(mǎn)足要求，脈沖盡量小。柱塞泵。
（5）、準(zhǔn)備上柱的液體應(yīng)進(jìn)行過(guò)濾，至少是0.45micrometre。
（6）、關(guān)于純化，**要考慮的是你的目標(biāo)：純度、數(shù)量、速度、收率等等，再根據(jù)樣品的具體情況，尤其是目標(biāo)蛋白的性質(zhì)，確定純化策略。通常三步曲：capture、purification、polishing。*步先從大量或復(fù)雜樣品中將目標(biāo)蛋白%26ldquo;抓出%26rdquo;，與主要雜質(zhì)分離；再用高選擇性的層析去除絕大部分雜質(zhì)；后精細(xì)純化，提供純度至設(shè)定目標(biāo)。到實(shí)際工作中，不要死靠三步，也許一步也許四步或更多，具體情況具體分析。所謂%26ldquo;三步%26rdquo;只是一種思路而已。
（7）、至于測(cè)序，我想大概不到1mg 應(yīng)該足夠了。
常壓反相硅膠柱的使用注意事項(xiàng)
C18反相硅膠的預(yù)處理很簡(jiǎn)單，就是用甲醇浸泡即可。上海五相儀器對(duì)其使用作如下說(shuō)明：使用的時(shí)候，將C18反相硅膠用甲醇混勻，攪拌，可以稍微超聲脫氣泡但不可時(shí)間太長(zhǎng)，5分鐘吧。然后勻漿裝柱，用甲醇沖洗柱子2-3個(gè)柱體積，將C18中的交聯(lián)劑之類(lèi)洗掉，然后用你的洗脫劑沖洗主子2-3個(gè)柱體積。洗脫劑的選擇可以根據(jù)液相也可以根據(jù)反相板。如果根據(jù)液相的話(huà)，需要將液相條件中的有機(jī)相減小10%作為洗脫劑為好。然后將你的帶分離物質(zhì)用洗脫劑溶解，上樣，加洗脫劑沖就可以了。反相硅膠可以反復(fù)使用，使用次數(shù)增多以后，有可能在柱子頂端產(chǎn)生顏色很深的色帶，可以選擇用丙酮沖洗，如果洗不掉可以選擇將其挖去，然后將主子內(nèi)C18硅膠保存在甲醇中即可。注意不要甲醇干了。
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