High Performance Liquid Chromatography

 Analysis  of  Saccharides

HPLC 糖類的分析

1. 簡(jiǎn)介

糖，包括食糖，是自然界廣泛生成的一類有機(jī)化合物，是我們身體的主要能源、人體組成的要素，同時(shí)也是參與多種生理功能的重要物質(zhì)，在我們?nèi)梭w中起著非常巨大的作用。因此，糖類的分析是生理學(xué)領(lǐng)域中的基本部分。糖類分析zui通用的方法是液相色譜法(HPLC)。本文將介紹HPLC分析糖類主要的分離和檢測(cè)方法。

2. 糖類的分析方法

糖類的種類繁多，分子量從180的單糖(例如葡萄糖)到幾百上千一直到幾百萬(wàn)的淀粉。單糖又被分為中性糖(如葡萄糖)、氨基糖(如氨基葡糖)、糖醛酸(如葡糖醛酸)和糖醇(如山梨醇)。另外，每種糖都有許多異構(gòu)體。

因此，用HPLC分析糖一定要有效地應(yīng)用的分離和檢測(cè)方法，還要考慮樣品化合物的濃度和類型。表1列出了HPLC糖分析的分離及檢測(cè)的方法。

表1 分離和檢測(cè)

                     凝膠色譜法

      分離           正相色譜法

                     配位體交換色譜法

                     陰離子交換 色譜法

                     紫外吸收檢測(cè)

      檢測(cè)           示差折光檢測(cè)

                     衍生(化學(xué)反應(yīng)檢測(cè))

3. 糖的HPLC分離方法

3.1 凝膠色譜法

凝膠色譜法是基于糖分子的大小進(jìn)行分離的方法。按照慣例我們可以使用右旋糖酐(dextran)和聚丙烯酰胺(polyacrylamide)凝膠作為柱填料，但是這些凝膠的缺點(diǎn)是不耐高壓，現(xiàn)在zui通用的填料是新開(kāi)發(fā)的可耐高壓的聚苯乙烯磺酸鈉和聚甲基丙烯酸酯甘油(glyceryl polymethacrylate)凝膠。

圖1 顯示的是幾種不同孔徑凝膠色譜柱分析聚乙二醇的校正曲線。

圖2 是用經(jīng)過(guò)選擇適合樣品的分子量

范圍的孔徑的凝膠色譜柱分析葡聚糖的洗

脫圖。

條件：

色譜柱： 500mmx8.0mm i.d.

流動(dòng)相： 水

流速：   1.0ml/min

溫度：   25 ℃

檢測(cè)器： 示差折光檢測(cè)器

峰：

  1.dextran MW500K,  2.dextran MW250K,  3.dextran MW150K,  4.dextran MW70K,

  5.dextran MW20K,    6.dextran MW10K,    7. 1,2-亞乙基二醇(HOCH2CH2OH)

值得注意的是用聚苯乙烯磺酸鈉凝膠色譜柱分析酸性的糖時(shí)，由于離子的排斥作用，洗脫非?？?，而分析基本糖類時(shí)，由于離子的相互作用，洗脫的要慢的多。

3.2 正相色譜法

正相色譜法分析從單糖到低聚糖非常有效，它甚至可以把低聚糖分離成單一組份以便定性。過(guò)去，正相色譜法分析糖時(shí)，用磺酸鹽型陰離子交換樹(shù)脂或鋰和銨鹽的正離子交換樹(shù)脂作填料，用乙醇/水作流動(dòng)相，但不幸的是，分析通常要耗時(shí)一小時(shí)以上。現(xiàn)在，用硅膠固定相和氨丙基(aminopropyl)化學(xué)結(jié)合作柱填料，乙腈(acetonitrile)和水作流動(dòng)相，糖在色譜柱中的保留取決于糖的劃分。

圖3 是糖標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖

條件：

色譜柱：Shim-pack CLC-NH2

        氨基柱(150mm X 6.0mm i.d.)

流動(dòng)相：乙腈/水=7/3(V/V)

流  速：1.0mL/min

溫  度：25℃

檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器

色譜峰：

1：丙三醇(glycerol)，2：木糖(xylose)，3：阿拉伯糖(arabinnose)，4：果糖(fructose)，

5：葡萄糖(glucose)，6：半乳糖(galactose)，7：蔗糖(sucrose)，8：麥芽糖(maltose)，

9：異麥芽糖(isomaltose)，10：麥芽三糖(maltotriose)

圖4 是同上色譜條件糖類的保留時(shí)間

1：溶劑，2：鼠李糖(rhamnose)，3：木糖(xylose)，4：來(lái)蘇糖(lyxose)，5：巖藻糖(fucose)，

6：阿拉伯糖(arabinose)，7：山梨糖(sorbose)，8：果糖(fructose)，9：甘露糖(mannose)，

10：葡萄糖(glucose)，11：山梨醇(sorbitol)，12：甘露糖醇(mannitol)，13：半乳糖(galactose)，

14：蔗糖(sucrose)，15：纖維素二糖(cellobiose)，16：麥芽糖(maltose)，17：麥芽糖醇(maltitol)，

18：肌醇(inositol)，19：海藻糖(trehalose)，20：異麥芽糖(isomaltose)，21：乳糖(lactose)，

22：蜜二糖(melibiose)，23：麥芽三糖(maltotriose)，24：蜜三糖(raffinose)，

25：麥芽四糖(maltotetraose)，26：麥芽五糖(maltopentaose)

正相色譜法可以分離二糖酶(disaccharides)，這對(duì)于體積排除法和配位體交換法很困難。正相色譜法分析中，通過(guò)調(diào)整乙腈和水的比率可以控制糖的分離及保留時(shí)間，增大水的濃度，可以加快糖的洗脫，并使大分子量的糖加快到合理的時(shí)間洗脫出來(lái)。

圖5 是葡萄糖及其低聚物(二聚物(dimer)到

     六聚物(hexamer))的色譜圖

條件：

色譜柱：Shim-pack CLC-NH2

        氨基柱(150mm X 6.0mm i.d.)

流動(dòng)相：乙腈/水=6/4(V/V)

流  速：1.2mL/min

溫  度：25℃

檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器

色譜峰：

1：葡萄糖， 2：麥芽糖， 3：麥芽三糖(maltotriose)，4：麥芽四糖(maltotetraose)，

5：麥芽五糖(maltopentaose)，6：麥芽六糖(maltohexaose)

在此分析中，水的濃度增加到了40%，進(jìn)一步增加水的濃度，可以分離含有10至15個(gè)葡萄糖分子的化合物。相反，降低水的濃度，可以改善單聚物(monomer)的分離，但是，如果濃度低于20%，由于溶解度的降低，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)不對(duì)稱峰。作為流動(dòng)相，乙基乙酸丙酮(acetone-ethyl acetate)/水也可以用于糖類的分析，它的特點(diǎn)是毒性比乙腈/水低。近來(lái)，樹(shù)脂(不是硅膠)色譜柱在正相色譜法中越來(lái)越流行，由于填料不易水解(hydrolyze)，所以樹(shù)脂色譜柱更耐用。也有些學(xué)者提出用十八烷基(octadecyl)和硅或硅膠化學(xué)結(jié)合作色譜柱，乙腈/水加胺(amine)作流動(dòng)相來(lái)分析糖類。

3.3 配位體交換色譜法

用聚苯乙烯磺酸鈉凝膠(sodium sulfonated polystyrene gel)色譜柱無(wú)法分離相同分子量的二聚糖和更高分子量的糖，但是，它可以分離一些相同分子量的單糖，象葡萄糖和果糖。配位體交換色譜法是又一種HPLC分析糖的方法，通過(guò)選擇Ca+、Na+、Pb+ 等相對(duì)離子(counter-ion)，可以改變單糖的選擇性，從而改善它們的分離。此種方法有一個(gè)廣為人知的優(yōu)點(diǎn)，就是只用水作流動(dòng)相，分析簡(jiǎn)單，因此，近來(lái)一系列各式各樣相對(duì)離子的色譜柱已經(jīng)得到了廣泛的商業(yè)應(yīng)用。

在分析過(guò)程中，糖主要通過(guò)與金屬性的相對(duì)離子結(jié)合而被保留，保留時(shí)間取決于它們和金屬性相對(duì)離子的水合分子相互作用所產(chǎn)生的結(jié)合物的穩(wěn)定性。圖6、圖7和圖8分別提供了含有Na、Ca、Pb的聚苯乙烯磺酸鹽硅膠色譜柱分析糖所得到的色譜圖。

圖6.使用Na型柱Shim-pack SCR-101N

條件：

色譜柱：Shim-pack SCR-101N

        (300mm x 7.9mm i.d.)

流動(dòng)相：水

溫  度：60℃

流  速：0.6mL/min

色譜峰：

1：葡聚糖MW10K(dextran MW10K)，2：蔗糖，3：葡萄糖，4：果糖，5：酒精(ethanol)

圖7.使用Ca型柱Shim-pack SCR-101C

條件：

色譜柱：Shim-pack SCR-101C

        (300mm x 7.9mm i.d.)

流動(dòng)相：水

溫  度：80℃

流  速：1.0mL/min

色譜峰：

1：葡聚糖MW10K(dextran MW10K)，2：麥芽三糖，

3：麥芽糖，4：葡萄糖，5：果糖，

6：丙三醇(glycerol)，7：酒精，8：山梨醇(sorbitol)

圖8.使用Pb型柱Shim-pack SCR-101P

條件：

色譜柱：Shim-pack SCR-101P

        (300mm x 7.9mm i.d.)

流動(dòng)相：水

溫  度：80℃

流  速：0.6mL/min

色譜峰：

1：蔗糖，2：葡萄糖，3：木糖(xylose)，

4：半乳糖(galactose)，5：阿拉伯糖，6：果糖，

7：丙三醇(glycerol)，8：甘露糖醇(mannitol)，9：核糖(ribose)，10：山梨醇(sorbitol)

圖9.列出了糖的保留時(shí)間，Ca柱分離單糖的效果比Na柱好，而Pb柱得到更好的分離效果；Ca柱和Pb柱對(duì)糖醇的保留長(zhǎng)一些，可以分離葡萄糖和山梨醇，這對(duì)于Na柱是作不到的。在配位體交換色譜法分析中，色譜柱要保持較高的溫度，圖10 表示色譜圖隨溫度變化的關(guān)系。當(dāng)色譜柱保持室溫時(shí)，葡萄糖，一種還原糖，分成了兩個(gè)峰，這是端基異構(gòu)體(anomer)造成的，隨著溫度的增加，變旋作用的速度也隨之增強(qiáng)，兩個(gè)峰逐漸合為一個(gè)峰。另一方面，羥基(OH- )對(duì)變旋作用起著催化劑的作用，在流動(dòng)相中加入象三乙胺(triethylamine)這樣的化合物，和升高柱溫的效果是相同的，在這種情況下，色譜柱要換成Ca柱。

圖9.Shim-pack SCR分析糖的洗脫時(shí)間

1：蜜三糖，2：麥芽三糖，3：蔗糖，4：麥芽糖，5：乳糖，6：葡萄糖，7：甘露糖醇，

8：鼠李糖，9：山梨醇，10：半乳糖，11：甘露糖，12：木糖，13：果糖，14：肌醇，

15：木糖醇，16：巖藻糖，17：阿拉伯糖，18：丙三醇，19：核糖，20：乙醇

圖10.溫度對(duì)分離的影響

條件：

色譜柱： Shim-pack SCR-101C (300mm x 7.9mm i.d.)

流動(dòng)相：水              流速：0.8mL/min

色譜峰：1：蔗糖，2：葡萄糖，3：山梨醇

3.4 陰離子交換色譜法

糖的羥基團(tuán)呈弱酸性，分裂常數(shù)也很低，約為10-12。因此，在陰離子交換色譜法分析糖時(shí)，流動(dòng)相的PH值要大于12，并且HPLC系統(tǒng)也要經(jīng)受同樣的條件。然而，還有另外一種交換的方法，就是由于象糖類這樣的聚羥基(polyhydroxy)化合物可以和硼酸(boric acid)反應(yīng)產(chǎn)生帶負(fù)電荷的聯(lián)合體(如圖11)，因此，用硼酸緩沖溶液作流動(dòng)相，通過(guò)糖和硼酸反應(yīng)，可以進(jìn)行糖的分析。

圖11： 

圖12.是一個(gè)用Shim-pack ISA-07色譜柱得到的典型的陰離子交換法分析糖的色譜圖。糖/硼酸聯(lián)合體陰離子交換對(duì)二聚糖和單糖的*分離非常有效，它提供的分離度遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于其它方法，不幸的是，不同組份的保留時(shí)間差別很大，二聚糖和單糖的分離要耗費(fèi)很長(zhǎng)時(shí)間，色譜峰也比較寬，在同等條件下，不可能有高的分析效率。目前，分析中通常使用梯度模式，硼酸緩沖溶液和流動(dòng)相的PH值隨時(shí)間的變化而變化，因此，也需要恰當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法與之相適應(yīng)。

圖12.用Shim-pack ISA-07色譜柱得到的典型的陰離子交換法分析糖的色譜圖

條件：

色譜柱：Shim-pack ISA-07

        (250mm x 4.0mm i.d.)

流動(dòng)相：300mM(鉀potassium)

        硼酸鹽(borate)緩沖液

流  速：0.6mL/min

溫  度：65℃

檢  測(cè)：精氨酸(arginine)柱后衍生 熒光 Ex:320nm, Em:430nm

色譜峰：

1：甘露糖，2：果糖，3：半乳糖，4：木糖，5：葡萄糖

4. 糖的檢測(cè)方法

4.1 吸收檢測(cè)法

紫外( ultraviolet )吸收分光光譜法是HPLCzui通用的檢測(cè)方法， 可是由于糖的吸收波長(zhǎng)較短(約在190nm)， 在此波長(zhǎng)下， 流動(dòng)相和雜質(zhì)的影響較大，所以它不太適用于糖類的分析。但糖醛酸(uronic)和唾液酸(sialic acid)的吸收波長(zhǎng)約在200至210nm，因而可以用這種方法檢測(cè)。圖13為血清酸性水解物中唾液酸的色譜圖。

條件：

色譜柱：Shim-pack SCR-101H

        (300mm x 7.9mm i.d.)

流動(dòng)相：10mM磷酸水溶液

流  速：1.5mL/min

溫  度：55℃

檢測(cè)器：205nm

4.2 示差折光檢測(cè)法

示差折光檢測(cè)器目前廣泛地應(yīng)用于HPLC糖的檢測(cè)，高靈敏度、穩(wěn)定的示差折光檢測(cè)器的利用，可以使我們檢測(cè)到低于100ng的糖，圖14是高靈敏度HPLC檢測(cè)糖的譜圖。盡管經(jīng)常使用這種檢測(cè)器分析糖，但當(dāng)我們作痕量分析特別象生化樣品這樣雜質(zhì)較多的樣品時(shí)，往往得不到令人滿意的結(jié)果。還有一個(gè)不足之處，就是它不能用于梯度洗脫，這就意味著它不能用于硼酸緩沖溶液的陰離子交換法(見(jiàn)第3.4節(jié))，影響多組份樣品的分析。

圖14 示差折光檢測(cè)器測(cè)糖

條件：

色譜柱：Shim-pack SCR-101N

        (300mm x 7.9mm i.d.)

流動(dòng)相：水

流速：  1.0mL/min

溫度：  50℃

檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器

色譜峰：

1.蔗糖，2.葡萄糖，3.果糖，各200ng

4.3 衍生(化學(xué)反應(yīng)檢測(cè)法)

在液相色譜法中，經(jīng)常通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)脑噭┡c樣品衍生，使之在紫外或可見(jiàn)波段產(chǎn)生吸收，或產(chǎn)生熒光，以增強(qiáng)檢測(cè)的靈敏度和選擇性。這種方法在需要準(zhǔn)確無(wú)誤地檢測(cè)出混合樣品中痕量化合物的生化領(lǐng)域特別有效。許多衍生的方法已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，并被廣泛地應(yīng)用。

衍生法在HPLC分析糖時(shí)也非常有效，又分為柱前衍生和柱后衍生。

4.3.1 柱前衍生法

在柱前衍生法中，由于目標(biāo)化合物優(yōu)先在進(jìn)入分析柱之前衍生，因此試劑、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等條件，比起柱后衍生法來(lái)說(shuō)，可以在較寬的范圍內(nèi)選擇，即使反應(yīng)試劑被檢測(cè)出來(lái)，只要把它和目標(biāo)化合物分離，也不會(huì)產(chǎn)生問(wèn)題，但樣品的前處理要簡(jiǎn)單而快速。對(duì)于柱前衍生法分析糖，用肼(dansylhydrazine)和 2-氨基嘧啶(2-aminopyridine)作試劑，酯化作用法和熒光衍生法均非常有效。在糖蛋白寡糖鏈的分析中，2-氨基嘧啶作試劑有著特殊的效果。

4.3.2 柱后衍生法

在柱后衍生法中，目標(biāo)化合物在分離后被衍生。這種方法有幾個(gè)條件必須被滿足：由于衍生試劑是連續(xù)地被加入到流動(dòng)相中，因此它不能被檢出；為保證良好的峰形，反應(yīng)時(shí)間要盡可能的縮短；zui后，為使系統(tǒng)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)練和操作簡(jiǎn)單，試劑的數(shù)量要盡可能少。盡管有這些要求，柱后衍生法還是有許多引人注目的優(yōu)點(diǎn)，它有良好的重現(xiàn)性和線性，更適合于自動(dòng)分析。

圖15是島津公司糖分析系統(tǒng)(梯度洗脫系統(tǒng))的流路圖，該系統(tǒng)采用柱后熒光衍生法，精氨酸(arginine)作衍生試劑。

圖中裝置分別為：

1：泵，2：流動(dòng)相，3：進(jìn)樣器，4：色譜柱

5：柱箱，6：泵，  7：試劑， 8：反應(yīng)器

9：反應(yīng)室，10：熒光檢測(cè)器，

11：數(shù)據(jù)處理機(jī)，12：阻尼器，13：廢液

總之，正相色譜法、凝膠色譜法、配位體交換色譜法都可以分析糖類，但用硼酸緩沖溶液的陰離子交換色譜法可以得到*的效果。圖16是一個(gè)高靈敏度分析的實(shí)例，圖17是梯度洗脫系統(tǒng)的實(shí)例。另外，電化學(xué)檢測(cè)器也可以用于糖的分析。

圖16.    條件：

色譜柱：Shim-pack ISA-07

        (250mm x4.0mm i.d.)

流  速：0.6mL/min

溫  度：65℃

流動(dòng)相：300mM(鉀potassium)硼酸鹽緩沖液

檢  測(cè)：精氨酸柱后衍生法，熒光：Ex320nm，Em430nm

色譜峰：

1：蔗糖，2：麥芽糖，3：鼠李糖，4：甘露糖，5：果糖，6：半乳糖，7：木糖，8：葡萄糖

除蔗糖為 1nmol 外，其余均為 100pmol.

圖17     條件：

色譜柱：Shim-pack ISA-07

        (250mm x4.0mm i.d.)

流  速：0.6mL/min

溫  度：65℃

流動(dòng)相：A：100mM(鉀potassium)硼酸鹽緩沖液

        B：400mM(鉀potassium)硼酸鹽緩沖液

        梯度： from A to B 50min

檢  測(cè)：精氨酸柱后衍生法，熒光：Ex320nm，Em430nm

色譜峰：

1：蔗糖，2：纖維二糖(cellobiose)，3：麥芽糖，4：(loctose)，5：鼠李糖，6：核糖，

7：甘露糖，8：阿拉伯糖，9：半乳糖，10：異麥芽糖，11：木糖，12：葡萄糖