嗜熱脂肪芽孢桿菌的鑒定方法及應(yīng)用！

嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）屬嗜熱性需氧芽孢桿菌，但兼有厭氧的特性，細菌繁殖體G蘭氏染色陽性呈紫色，細菌芽胞孔雀綠著色。嗜熱脂肪芽孢桿菌比較容易識別且對人體沒有危害性，一般作為空間消毒的指示生物。由中國*2015年發(fā)布的《濕熱滅菌用生物指示劑》（GB 18281.3-2015）于2017年01月01日正式實施，正式將嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）改稱為嗜熱脂肪地芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus）。

一、主要特性

嗜熱脂肪地芽孢桿菌營養(yǎng)細胞呈長桿狀、圓端，多數(shù)為單個、少數(shù)成對或鏈狀排列，細胞寬 0． 6 ～ 1.μm、長 2. 0 ～ 3.5μm，細胞壁為革蘭陽性結(jié)構(gòu)，但染色可在陽性和陰性之間變化。芽孢呈橢圓或柱狀、端生或次端生，孢囊膨脹或不膨脹，無伴孢晶體形成。生長溫度為 56 ～ 60℃，生長溫度為 65 ～ 75℃，低生長溫度為 30 ～ 45℃，需氧或兼性厭氧，利用葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣?，F(xiàn)中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心( CICC) 收藏菌株為嗜熱脂肪地芽孢桿菌編號為 CICC 10267 株，即 ATCC 7953 株，其在營養(yǎng)瓊脂上56℃培養(yǎng) 24h 的菌落形態(tài)呈淺黃色，表面粗糙濕潤，邊緣不整齊 ; 該菌株在 Cook等產(chǎn)孢培養(yǎng)基上 56℃培養(yǎng) 24 h，取菌苔涂片經(jīng)芽孢染色法染色后，1 000倍光學(xué)顯微鏡下觀察到多數(shù)仍為染成紅色的繁殖體與部分已經(jīng)形成染成藍色的芽孢形態(tài) ; 在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上 56℃培養(yǎng) 5 d，鏡下觀察到 90% 以上為已經(jīng)形成染成藍色的芽孢，只有少數(shù)是染成紅色的繁殖體。

二、分類學(xué)演變歷程

1917 年 Smith 等人在實驗室分離出嗜熱脂肪地芽孢桿菌，1920 年 Donk 將其歸類于芽孢桿菌屬( Bacillus) ，并命名為嗜熱脂肪芽孢桿菌( Bacillus stearothermophilus)。傳統(tǒng)分類上對于芽孢桿菌屬的分類標準較為寬松，導(dǎo)致該屬細菌在生理、基因等方面存在很大差異。近年來隨著分類學(xué)研究的不斷深入，DNA G + C mol% 、16S rDNA 序列分析、核酸雜交等分類技術(shù)的不斷發(fā)展，芽孢桿菌屬細菌的分類也得到更改與修正。 1949 年，Gordon 和 Smith對收集到的 216 株細菌進行分類研究，其中 160 株被歸類于兩個嗜熱菌種：嗜熱脂肪芽孢桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌( B． coagulans) ，他們認為這兩個菌種各自代表了一組需氧、嗜熱、形成芽孢的細菌。

1991 年 Ash等對 51 種芽孢桿菌屬菌種的 16S rDNA 完整序列進行了分析，根據(jù)分析結(jié)果將它們分成 5 個不同的系統(tǒng)發(fā)育類群，并認為這 5 個類群明顯代表著不同的菌屬；同時提出芽孢桿菌屬菌種在遺傳方面相當(dāng)混亂，需對其進行大量的分類學(xué)修正。Ash 等的研究成果標志著對芽孢桿菌屬進行重新分類的開始，此后從 1992 年至 1999 年陸續(xù)從芽孢桿菌屬中獨立出 8 個新屬。

2001 年，Nazina等對芽孢桿菌屬的嗜熱菌組群進行了生理特性對比研究，在此基礎(chǔ)上，又對其進行脂肪酸分析、 DNA － DNA 雜交、16S rDNA 序列分析等一系列分類學(xué)研究。研究認為它們是一組系統(tǒng)發(fā)育相近、生理和形態(tài)相似的細菌，可以組成新的菌屬，并就此提出了一個新的菌屬名稱: 地芽孢桿菌屬( Geobacillus) 。Nazina 等將包括嗜熱脂肪芽孢桿菌在內(nèi)的 6 種菌從芽孢桿菌屬分離出來，與近發(fā)現(xiàn)的新種一起歸類為地芽孢桿菌屬，該屬已得到上的*。地芽孢桿菌屬中現(xiàn)已確切描述并命名的共有 21 個種及亞種，模式種為嗜熱脂肪地芽孢桿菌，模式菌株為 DSM 22T( = ATCC 12980 T) 。

菌種保藏機構(gòu)如 ATCC 和 DSMZ，以及標準和藥典等，已經(jīng)將 Bacillus stearothermophilus 更名為Geobacillus stearothermophilus，國內(nèi)仍稱為嗜熱脂肪芽孢桿菌( Bacillus stearothermophilus) 。

三、鑒定方法

對于嗜熱脂肪地芽孢桿菌的鑒定，傳統(tǒng)分類中根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特性、生態(tài)特性等指標進行鑒定的方法耗時耗力，因此基于分子生物學(xué)的鑒定方法不斷發(fā)展。2005 年， Daniel R． Zeigler報道了利用 recN 基因序列相似性分析鑒定地芽孢桿菌屬菌種的研究。研究表明，對于屬、種及亞種水平的分類，recN 基因序列分析的鑒定分辨率接近甚至比 16S rDNA 序列分析更高，但突變飽和度限制了 recN 基因序列對更高層次分類的應(yīng)用，然而 recN 基因序列分析對地芽孢桿菌屬菌株種的鑒定具有重要作用。2007 年，Nomeda Kuisiene等報道了利用 AluI 限制性內(nèi)切 16S rDNA 擴增片段來鑒定嗜熱脂肪地芽孢桿菌的方法。使用限制酶 AluI 將 16S rDNA 酶切，嗜熱脂肪地芽孢桿菌的 16S rDNA 酶切電泳圖將呈現(xiàn)出特殊條帶: 162bp 條帶的出現(xiàn)和 76bp 與 86bp 條帶的缺失。同年，Nomeda Kuisiene等又報道，以 16S － 23S rDNA 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列為靶基因設(shè)計特異性引物GEOBAC，以其 PCR 產(chǎn)物來鑒定地芽孢桿菌屬菌種。這些快速而準確的鑒定方法為嗜熱脂肪地芽孢桿菌及地芽孢桿菌屬其它菌種的研究與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

四、應(yīng)用

1、生物指示劑標準菌

嗜熱脂肪地芽孢桿菌( ATCC 7953) 所產(chǎn)芽孢無致病性、無熱原、無毒，且對壓力蒸汽的抵抗力在大多數(shù)微生物中，因此被歐洲藥典、美國藥典、日本藥典等作為熱力滅菌生物指示劑的標準菌株收錄。我國衛(wèi)生部也將該菌株作為壓力蒸汽滅菌效果評價的標準檢測菌株列入《消毒與滅菌效果的評價方法與標準》( GB 15981 － 1995) 和《消毒技術(shù)規(guī)范》( 2002 版) ; 同時，*也將其作為濕熱滅菌用生物指示物列入《醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌生物指示物》( GB 18281.3 － 2000) 標準中。嗜熱脂肪地芽孢桿菌( ATCC 7953) 用于制備生物指示劑重要的技術(shù)指標就是對一定滅菌因子有確定的抗力。 2002 年版《消毒技術(shù)規(guī)范》中明確規(guī)定嗜熱脂肪地芽孢桿菌( ATCC 7953) 芽孢滅菌生物指示劑在 121℃ ± 0. 5℃ 條件下的抗力指標: 存活時間≥3.9min，殺滅時間≤19min，D 值為1. 3min － 1. 9min。然而同一菌株培養(yǎng)出的芽孢，其抗力也可能不同，此與培養(yǎng)方法和營養(yǎng)成分有關(guān)。Beaman等對該菌株粗糙型和光滑型芽孢 100℃條件下的 D 值進行了測定，分別為 124 min 和579 min，因此制備生物指示劑必須嚴格確定菌株與菌落形態(tài)。此外，培養(yǎng)基成分不但對芽孢生成率有顯著影響，對芽孢的熱抗力也有明顯作用，如芽孢形成培養(yǎng)基中鈣離子濃度增加，可使芽孢的熱抗力增加。芽孢的形成溫度對芽孢的熱抗力也有一定影響，Cook 等的研究表明，在 50℃、55℃、60℃ 條件下形成的芽孢，培養(yǎng)溫度越高抗熱能力越強。綜上所述，生物指示劑的熱抗力受多種因素影響，故對其制備條件應(yīng)予嚴格控制; 同時對生物指示劑產(chǎn)品，必須使用符合標準的抗力檢測器對其抗力性能進行嚴格測試。

2、鮮乳中抗生素殘留檢驗

長期以來，抗生素在奶牛飼養(yǎng)業(yè)中應(yīng)用廣泛，如為預(yù)防或治療疾病，常在飼料中添加含有一定比例抗生素的飼料添加劑，這對于長期飲用牛奶的消費者來說無疑是等于長期服用小劑量的抗生素，因此必須嚴格控制抗生素殘留*。國標 CB/T 4789. 27 － 2008 中規(guī)定了兩種檢測鮮乳中抗生素殘留的方法 － 嗜熱鏈球菌抑制法和嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法。嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法中所用菌種為嗜熱脂肪芽孢桿菌卡利德變種( Bacillus stearothermophilus var． calidol- actis)，該菌種在的保藏機構(gòu) DSMZ 中已更名為嗜熱脂肪地芽孢桿菌。該菌種對青霉素等抗生素非常敏感，生長速度快，此外其還有一個重要特性是生長溫度范圍較高，僅有少數(shù)微生物可在該溫度范圍內(nèi)生長，因此雜菌影響結(jié)果的可能性很小。

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