過氧化氫酶的活性測定

來源：上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司 2011年08月01日 15:37

過氧化氫酶的活性測定——高錳酸鉀滴定法

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一、原理

過氧化氫酶屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過氧化氫分解為水和分子氧，在此過程中起傳遞電子的作用，過氧化氫則既是氧化劑又是還原劑。

R（Fe²⁺）+H₂O₂⇒R（Fe³⁺+OH^-）

R（Fe³⁺+OH^-）₂+H₂O₂⇒R（Fe²⁺）₂+2H₂O+O₂

據(jù)此，可根據(jù)H₂O₂的消耗量或O₂的生成量測定該酶活力大小。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量的H₂O₂溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的H₂O₂。

5H₂O₂+2KMnO₄+4H₂SO₄⇒5O₂+2KHSO₄+8H₂O+2MnSO₄

即可求出消耗的H₂O₂的量。

二、儀器和用具

研缽；三角瓶50ml 4個(gè)；10ml酸式滴定管；恒溫水浴鍋；容量瓶25ml 1個(gè)。

三、試劑

10%H₂SO₄；

0.2mol/L磷酸緩沖液PH7.8；

0.1mol/L高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液：稱取KMnO₄（AR）3.1605g，用新煮沸冷卻蒸餾水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液標(biāo)定；

0.1Mol/L H₂O₂：市售30%H₂O₂大約等于17.6Mol/L，取30%H₂O₂溶液5.68ml，稀釋至1000ml，用標(biāo)準(zhǔn)0.1Mol KMnO₄溶液（在酸性條件下）進(jìn)行標(biāo)定；

0.1Mol/L草酸：稱取優(yōu)級純H₂C₂O₂·2H₂O 12.607g，用蒸餾水溶解后，定容至1L。

四、方法

1. 酶液提?。喝⌒←溔~片2.5g加入pH7.8的磷酸緩沖液少量，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，用該緩沖液沖洗研缽，并將沖洗液轉(zhuǎn)入容量瓶中，用同一緩沖液定容，4000r/min離心15min，上清液即為過氧化氫酶的粗提液。

2. 取50ml三角瓶4個(gè)（2個(gè)測定，2個(gè)對照），測定瓶中加入酶液2.5ml，對照瓶中加入煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H₂O₂，同時(shí)計(jì)時(shí)，于30℃恒溫水浴中保溫10min，立即加入10%H₂SO₄ 2.5ml。

3. 用0.1mol/L KMnO₄標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定H₂O₂，至出現(xiàn)粉紅色（在30min內(nèi)不消失）為終點(diǎn)。

4. 結(jié)果計(jì)算：酶活性用每克鮮重樣品1min內(nèi)分解H₂O₂的毫克數(shù)表示：

酶活（Mg/g·Min）=（A-B）×VT×1.7FW×V1×t　　　　　　　（3-2）

式中：A：對照KMnO₄滴定毫升數(shù)（ml）；B：酶反應(yīng)后KMnO₄滴定毫升數(shù)（ml）；VT：酶液總量（ml）；V1：反應(yīng)所用酶液量（ml）；W：樣品鮮重（g）；1.7FW：1ml 0.1mol/L的KMnO4相當(dāng)于1.7mgH₂O₂。

五、注意

所用KMnO₄溶液及H₂O₂溶液臨用前要經(jīng)過重新標(biāo)定。

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