人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定方法！

一、背景及概述

上皮細(xì)胞覆蓋于身體表面并襯貼于體內(nèi)空腔器官腔面的細(xì)胞。其排列有明顯極性，一面朝向身體表面或腔面，稱游離面；一面向著深部的結(jié)締組織，稱基底面。上皮細(xì)胞具有強(qiáng)大的角生和更新能力。上皮組織具有保護(hù)、吸收、分泌和排泄等作用。當(dāng)上皮細(xì)胞受損時(shí)，則影響機(jī)體的防御功能。

人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分離自視網(wǎng)膜組織；視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）位于脈絡(luò)膜和光感受器細(xì)胞外節(jié)之間，是視網(wǎng)膜下腔和脈絡(luò)膜血管之間的離子、水、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝終產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)通道；主要是由單層色素上皮細(xì)胞所構(gòu)成，排列十分規(guī)則。人視網(wǎng)膜色素上皮參與視黃醇循環(huán)，吞噬脫落的光感受器細(xì)胞外節(jié)以維持光感受器細(xì)胞興奮性，并分泌多種生長(zhǎng)因子，幫助維持脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞和光感受器細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性。細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞分為三部分，即頂部、體部和基底部。

人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞無(wú)再生能力，細(xì)胞死亡后不被替換，而是鄰近的細(xì)胞向側(cè)面滑動(dòng)，以*死亡細(xì)胞遺留下來(lái)的空間。人視網(wǎng)膜色素上皮位于脈絡(luò)膜和光感受器細(xì)胞外節(jié)之間，是視網(wǎng)膜下腔和脈絡(luò)膜血管之間的離子、水、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝終產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)通道。人視網(wǎng)膜色素上皮參與視黃醇循環(huán)，吞噬脫落的光感受器細(xì)胞外節(jié)以維持光感受器細(xì)胞興奮性，并分泌多種生長(zhǎng)因子，幫助維持脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞和光感受器細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性。

二、凍存和復(fù)蘇

根據(jù)慢凍速融的細(xì)胞凍存原則，將原代或傳代1-2次培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，加入10％二甲基亞砜作為保護(hù)劑，液氮中凍存。復(fù)蘇時(shí)將凍存細(xì)胞在60℃、2分鐘內(nèi)融化，用臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞存活率，用抗人角蛋白抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色作細(xì)胞鑒定，每日計(jì)算細(xì)胞數(shù)以確定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示經(jīng)凍存復(fù)蘇后的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的存活率達(dá)90％，生長(zhǎng)狀態(tài)與對(duì)照組無(wú)差異，抗人角蛋白染色陽(yáng)性，細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期在1-4天，群體細(xì)胞倍增期約為1.55天。因此人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞液氮凍存可保持生物活性，復(fù)蘇后生長(zhǎng)良好，保持了細(xì)胞特征。這可提供細(xì)胞系，方便了體外實(shí)驗(yàn)，并可能作為人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞移植治療一些眼底病的細(xì)胞庫(kù)。

三、培養(yǎng)和鑒定

有研究進(jìn)行人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)，為研究其生理功能、生化特征和病理過(guò)程提供細(xì)胞模型。

1、方法：用改良的眼杯縫線固定法，將其固定在眼球托上，通過(guò)消化獲取人人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，作細(xì)胞形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)和電鏡鑒定。

2、結(jié)果：人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)早期生長(zhǎng)活躍、胞核透明、胞漿含豐富黑色素顆粒，Ｇｉｅｍｓａ染色見染色體，ＤＯＰＡ氧化酶呈陽(yáng)性反應(yīng)，透射電鏡見細(xì)胞微絨毛及緊密連接。、人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)及短期傳代后，仍具有與體內(nèi)細(xì)胞相似形態(tài)特征?？蔀槿艘暰W(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的深入研究提供豐富的實(shí)驗(yàn)研究材料。

四、相關(guān)研究

有實(shí)驗(yàn)研究可見光照對(duì)培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮(retinalpigmentepithelium，RPE)細(xì)胞凋亡的影響。以白色熒光燈為光源，用500lx、(2000±500)lx及(3400±200)lx不同光照強(qiáng)度，按不同的光照時(shí)間(無(wú)光照、6、12、24h)照射培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞。利用終末脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL)、熒光素標(biāo)記的連接素V/碘化丙錠(AnnexinV-FITC/PI)雙染色流式細(xì)胞測(cè)定、相差倒置顯微鏡等手段觀察RPE細(xì)胞凋亡(分為光照后6、12、24、36h組)。結(jié)果可觀察到RPE細(xì)胞出現(xiàn)兩種死亡形式，凋亡與壞死。

(1)低于一定閾值(500lx)的光照對(duì)細(xì)胞損傷較輕，細(xì)胞凋亡及壞死隨光照強(qiáng)度的增加而增加。

(2)在較短的光照時(shí)間(6h和12h)內(nèi)，細(xì)胞死亡的增加以凋亡為主；隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞壞死逐漸明顯。

(3)隨著光照后培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡明顯增加(P0.05)。光照后6、12、24h的損傷改變以凋亡為主，但隨時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡繼發(fā)性壞死的增加顯著。光照后36h，細(xì)胞的壞死數(shù)顯著增高。　

此外，有研究探討天冬酰胺特異酶切的半胱氨酸蛋白酶(caspase)成員caspase-3在柔紅霉素誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞凋亡中的變化。方法：原代培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞經(jīng)200μg·L-1柔紅霉素誘導(dǎo)8，24和36h后，按照caspase-3熒光檢測(cè)試劑盒說(shuō)明處理細(xì)胞，再通過(guò)熒光比色法間接檢測(cè)細(xì)胞碎片中caspase-3的活性。結(jié)果正常caspase-3的活性為(0.094±0.005)nmolAFC，8h后增加為(0.446±0.029)nmolAFC，24h后為(0.754±0.056)nmolAFC，36h又下降到(0.486±0.033)nmolAFC，但都高于正常水平。加入特異性四肽抑制物DEVD-CHO1μL后活性為(0.040±0.003)nmolAFC，顯著低于正常。因此Caspase-3參與了柔紅霉素誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的凋亡，柔紅霉素可使其活性增加。

另外，有研究探討藍(lán)光光照對(duì)體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞凋亡及對(duì)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響。方法用藍(lán)光光照體外培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為三部分。部分：不同光照度，分為3組，第1組光照度(500±100)lx，第2組光照度(2000±500)lx，第3組光照度(3000±500)lx；光照RPE細(xì)胞時(shí)間6h，光照結(jié)束后24h終止培養(yǎng)。第二部分：同一光照度、不同光照時(shí)間，檢測(cè)RPE細(xì)胞亞型時(shí)分為3組，第1組光照時(shí)間6h，第2組光照時(shí)間12h，第3組光照時(shí)間24h，光照度均為(2000±500)lx；檢測(cè)線粒體膜電位時(shí)也分為3組，第1組光照時(shí)間3h，第2組光照時(shí)間6h，第3組光照時(shí)間12h。

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