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了解生化分析儀基本參數(shù)的原理，有利于儀器、試劑的正確使用，有助于正確分析和處理測定數(shù)據(jù)。但是，配套系統(tǒng)的原裝分析參數(shù)不宜更改；采用非儀器配套的試劑及校準(zhǔn)品體系時，參數(shù)修改要慎重，對于不同儀器、不同類型的反應(yīng)分析程序，所顯示的人機(jī)對話分析參數(shù)信息有所不同。
一、反應(yīng)監(jiān)測時間
對于終點法來說，讀取反應(yīng)達(dá)到平衡時的吸光度計算樣品中待測物的濃度。對于連續(xù)監(jiān)測法來說，要注意觀察反應(yīng)進(jìn)程曲線，從而確定反應(yīng)的預(yù)孵育期，延遲時間、連續(xù)監(jiān)測的時段。對于一級或偽一級反應(yīng)來說，連續(xù)監(jiān)測的時間是一級反應(yīng)的動態(tài)期的吸光度；對于基于零級反應(yīng)的酶催化活性濃度速率法測定，連續(xù)監(jiān)測的是零級線性反應(yīng)期的吸光度。對于連續(xù)監(jiān)測法來說，動態(tài)反應(yīng)期的時間越長，越適用于臨床應(yīng)用，對于以酶為工具的代謝物酶促動力測定法，要增加動態(tài)反應(yīng)期，即延長反應(yīng)達(dá)到平衡的時間，可在反應(yīng)體系中加入競爭性抑制劑，這樣還可以提高測定的線性范圍，對于酶催化活性濃度連續(xù)監(jiān)測法來說，一定要注意線性反應(yīng)時間，有的酶，例如，以硫代丁酰膽堿為底物的血清假性膽堿酯酶速率測定法，線性反應(yīng)時間只有90秒。對于連續(xù)監(jiān)測法來說，在監(jiān)測期至少應(yīng)讀4個點(3個△A)。
多數(shù)全自動生化分析儀可以在整個測定反應(yīng)周期連續(xù)監(jiān)測(如HITACHI7170常規(guī)測定周期10分鐘、監(jiān)測34點，OLYMPUSAU600固定周期8分15秒、監(jiān)測27點)，但反應(yīng)監(jiān)測時間是指該時間內(nèi)的測定讀數(shù)要用于結(jié)果計算。它的設(shè)置與加樣點、加試劑點(包括R1、R2……)、監(jiān)測時間(讀數(shù)點)、讀數(shù)間隔時間及試劑樣品比例等有關(guān)，要結(jié)合方法學(xué)，兼顧權(quán)衡。
1.反應(yīng)時間(ReactionTime)指儀器的一個分析周期中，試劑和樣品混合末一點測定讀數(shù)時間。它對終點法尤其重要，是終點法的瓶頸。有的儀器多個反應(yīng)時間可選L如Hl—TACHI7170)，須預(yù)先選定。多數(shù)儀器10分鐘左右，這對試劑提出了較高要求。不少終點法試劑(尤其手工法試劑)反應(yīng)時間常常也在lO分鐘上下，測定時間沒有余地，當(dāng)樣品濃度高或試劑質(zhì)量下降時，均可致測定結(jié)果偏低。因此，終點法不宜采用標(biāo)明反應(yīng)時間接近和長于儀器大反應(yīng)時間的試劑盒。否則，必須用接近測定范圍上限的高濃度質(zhì)控血清監(jiān)測。
2.監(jiān)測時間(讀數(shù)點)和讀數(shù)間隔時間各類型儀器不盡一致。離心式生化儀讀數(shù)間隔時間短，監(jiān)測時間也短。流動式生化儀讀數(shù)間隔時間一般較長。分立式生化儀一般監(jiān)測時間10分鐘左右，間隔10-30秒讀數(shù)一次。有的儀器在整個測定反應(yīng)周期全程讀數(shù)，有的只讀取時間(點)的吸光度。
3.加試劑點采用雙試劑時，加R2點決定R1與樣品的反應(yīng)時間，也決定R2與R1及樣品的反應(yīng)時間。一般儀器各5分鐘左右。HITACHI7170有4個加試劑點，若采用雙試劑，各5分鐘，則加R2設(shè)在第3加試劑點。
4反應(yīng)監(jiān)測時間還要考慮延遲時間的長短、測定物質(zhì)的濃度范圍及相關(guān)臨床價值和工作效率等因素。
二、延遲時間
延遲時間(DelayTime)指試劑與樣品混合后到監(jiān)測開始之間的時間。一般用于兩點法和速率法，某些情況下也用于終點法。終點法應(yīng)選擇反應(yīng)趨于平衡的時間(穩(wěn)定期或平衡期)作測定，測定點前即所謂的孵育期。速率法的線性反應(yīng)期之前即延遲期。正確選擇延遲時間的長短，有利于準(zhǔn)確測定，減少試驗誤差。設(shè)置一般根據(jù)試劑盒的說明書，還應(yīng)考慮本室的儀器特點和工作程序。
1.儀器特點比如，半自動生化儀多為流動比色池，要考慮泵速、進(jìn)樣管長短、反應(yīng)液黏稠度及混合情況，以及室溫、反應(yīng)液溫度同反應(yīng)要求溫度間的溫差等。全自動生化儀的測定讀數(shù)設(shè)置方式不同，直接以“秒”設(shè)置，或以測定點設(shè)置、測定點間隔時間不一樣，需要靈活掌握。
2.試劑及方法學(xué)
(1)試劑組成在酶活性的連續(xù)監(jiān)測法時，若試劑含工具酶數(shù)量多、偶聯(lián)反應(yīng)多，則激活反應(yīng)時間一般較長，延遲時間也較長，如肌酸激酶(NAC法)延遲時間常設(shè)置120-180秒；若試劑中底物經(jīng)待測酶催化，其產(chǎn)物可以直接測定的，則延遲時間較短，如-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)設(shè)定30-60秒。同一項目同一方法，但試劑配方不同，其反應(yīng)快慢等特征也可能不同，如白蛋白測定。白蛋白與溴甲酚綠(BCG)為即時反應(yīng)，10秒鐘內(nèi)已完成，其后球蛋白等也將與BCG發(fā)生反應(yīng)，所以孵育時間不能延長。但在同一測定時間，BcG濃度、緩沖液種類、pH和表面活性劑不J司的試劑，測定結(jié)果可能差異明顯。
(2)樣品異常成分干擾有的試驗項目需要用工具酶將內(nèi)源性代謝產(chǎn)物耗盡，比如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性測定試劑中須有足量的乳酸脫氫酶(LDH)。如果使用單試劑，正常血清樣品延遲時間60秒即可；但當(dāng)內(nèi)源性酮酸增多(如酮癥酸中毒)時，試劑內(nèi)LDH常常不能在60秒內(nèi)*將其清除，剩余酮酸會進(jìn)入監(jiān)測期干擾測定，使測定結(jié)果偏高，所以延遲時間應(yīng)增至90～120秒。采用雙試劑，則可在加入R1后即進(jìn)入預(yù)孵育期。
(3)方法學(xué)要求比如肌酐(Jaffe法)測定的特異性不強(qiáng)，一般認(rèn)為反應(yīng)前20秒左右為乙酰乙酸等快反應(yīng)干擾物呈色，后約80～100秒為蛋白質(zhì)等慢反應(yīng)假肌酐呈色，20~60秒肌酐呈色反應(yīng)占主導(dǎo)地位。采用兩點法或速率法可減少干擾，但具體取多長的延遲時間，應(yīng)根據(jù)試劑和儀器讀數(shù)特點，以干擾試驗等方法來評價決定。
3.工作程序要在保證準(zhǔn)確性的前提下，合理設(shè)置參數(shù)，提高工作效率。突出的例子是半自動生化儀上酶活性連續(xù)監(jiān)測法的延遲時間設(shè)定。由于只能單份樣品逐一測定，若延遲時問全部設(shè)置在儀器內(nèi)，每個延遲時間加監(jiān)測時間至少1分鐘以上，守候時間較長。工作量大時，可以根據(jù)儀器控溫、加樣及讀數(shù)和試劑特點，以及室溫情況，將延遲時問挪一部分到機(jī)外，套式操作，但要確保機(jī)內(nèi)延遲時間不要進(jìn)入線性反應(yīng)期。
4.要兼顧延遲時間和監(jiān)測時間反應(yīng)時間是有限制的。在速率法和兩點法中，延長延遲時間必然縮短線性監(jiān)測期，減少測定的線性范圍，也易發(fā)生底物耗盡。
三、樣品量、試劑量與稀釋量
有關(guān)參數(shù)包括樣品量、試劑量、稀釋水量、小反應(yīng)體積和大比色杯容量等。如HITACHI7170反應(yīng)體積180~380µl，大體積570µl。BT224半自動生化儀流動比色池容積33µl，吸液量200～990µl，適體積500µl。
1.小反應(yīng)體積在儀器光度讀數(shù)要用于結(jié)果計算時，反應(yīng)液液面高度不低于光度計光徑的小體積。它保證儀器的正確讀數(shù)和計算，也是儀器測定精度和經(jīng)濟(jì)性的指針之一。在有的儀器中，它以反應(yīng)體積的下限表示，有的則專門標(biāo)明小反應(yīng)體積。在單試劑測定中，樣品與試劑的總體積不得少于此參數(shù)。在雙試劑測定中，若R1與樣品的反應(yīng)讀數(shù)不納入結(jié)果計算。R1自勺加液量可不考慮此參數(shù)，如連續(xù)監(jiān)測法；否則應(yīng)考慮它對結(jié)果的影響，如終點法在加R2之前讀數(shù)，并以此來扣除試劑或樣品空白時。
在半自動生化儀中，適吸人量相當(dāng)于少反應(yīng)體積。它與進(jìn)液管道長度、流動比色池容積，吸液泵抽吸力大小和液體黏稠度有關(guān)，它要保證光度檢測不受空泡和前后樣品攜帶污染的干擾。因此，吸人體積不能任意降低，必要時，應(yīng)加大反應(yīng)液量和吸人量。
2.大比色杯容量這個參數(shù)含義明確。在有的儀器中，它以反應(yīng)體積的上限表示，有的則專門標(biāo)明大比色杯容量。反應(yīng)液超過此體積，將致液體外溢，儀器測定系統(tǒng)被污損。
3.樣品試劑比例樣品與試劑的比例(SV：RV)，也可表示為樣品體積分?jǐn)?shù)——樣品體積與反應(yīng)液總體積的比值(SV/TV)，是方法學(xué)基本參數(shù)。酶活力測定中，樣品在總體積中的比例應(yīng)在10%以下。一般來說，待測物質(zhì)在樣品中含量低的、生理波動范圍大的，樣品用量較大。如Trinder反應(yīng)測定血清葡萄糖、膽固醇等，樣品試劑比例多為1：1OO，測定血尿酸或高密度脂蛋白膽固醇，常增加為1：50；ALT和AST的樣品試劑比例多為1：1O至1：20。方法靈敏、吸光度高的實驗方法，樣品試劑比例小,如白蛋白BCG法，樣品試劑比例常為1：200。肌酐Jaffe氏法監(jiān)測時間短、吸光度值較低，樣品試劑比例多為1：10。一般應(yīng)以試劑說明為準(zhǔn)，不宜輕易改動。
(1)改動樣品試劑比例，影響一系列方法學(xué)參數(shù)。若比例增大，則線性范圍縮小，線性反應(yīng)時間縮短，樣品內(nèi)源性干擾、基質(zhì)效應(yīng)增加、旁路反應(yīng)會增強(qiáng)，方法特異性也下降。若比例減少，檢測信號偏低，信噪比(噪音/信號)增大，當(dāng)儀器精度不高時，會加大測量誤差。
(2)改動樣品試劑比例，對某些反應(yīng)有影響。如堿性磷酸酶(AI_P)，有文獻(xiàn)報道：當(dāng)樣品試劑比例從1：25降至1：50時，酶活力測定值增加，再低于1：50時不再增加。這一效應(yīng)可能是較高稀釋度下AIJP多聚體解聚的結(jié)果。體液樣品稀釋也可能對測定結(jié)果產(chǎn)生影響：④大多數(shù)蛋白質(zhì)在濃溶液中的分子構(gòu)象比稀溶液中穩(wěn)定，樣品稀釋可影響酶的穩(wěn)定性。(2)降低樣品中內(nèi)源性抑制劑或激動劑的濃度，如以蒸餾水稀釋血清，可能因降低血清中淀粉酶的激動劑氯離子的濃度，致測定淀粉酶結(jié)果偏低；隨血清稀釋倍數(shù)增加，肌酸激酶測定活力增加，可能與降低樣品中AMt，、胱氨酸等內(nèi)源性抑制劑有關(guān)。
(3)雙試劑時要兼顧R1、R2和樣品三者的比例，尤其不宜改動試劑間的比例。R2要考慮儀器規(guī)定的加液小體積，同一試劑瓶死體積下分液量小而浪費大的經(jīng)濟(jì)問題等。
4.稀釋(水)量在加樣或加試劑時，加入去離子水或可以的液體。它的主要用途有兩個。一是用于濃縮試劑的稀釋，或樣品、校準(zhǔn)品的稀釋。二是在樣品加量小的時候用來沖洗樣品探針，減小攜帶誤差；但用量不宜太多，以免稀釋試劑影響反應(yīng)。要把稀釋水量納入樣品試劑比例和反應(yīng)液總體積考慮。必要時，干粉試劑復(fù)溶也要考慮此因素。
四、試劑空白(Reagentblank)監(jiān)測參數(shù)
無樣品或以水代替樣品在反應(yīng)過程中觀察試劑空白值或其變化情況，主要用于監(jiān)測試劑質(zhì)量及儀器穩(wěn)定性，利用試劑空白對試劑本身或反應(yīng)漂移引起的誤差進(jìn)行補(bǔ)償，用以校正△A或△A/min。它與測定波長、光徑大小、不同試劑及配方和樣品試劑比例等有關(guān)，不能盲目套用，必要時宜實際測定。
1.試劑吸光度上限和下限定點監(jiān)測試劑的吸光度。它常用規(guī)定波長及光徑下的吸光度值表示。儀器的試劑空白檢測點因儀器和測定方法的不同而有差異。終點法常在PO點讀數(shù)，連續(xù)監(jiān)測法常以反應(yīng)監(jiān)測起始點來判讀。儀器在試劑空白檢測及相關(guān)的校準(zhǔn)測定時，若監(jiān)測到超過此參數(shù)的限值，則提示試劑失效或校準(zhǔn)無效。反應(yīng)吸光度向上的試驗取上限值：如Trinder反應(yīng)以酚或2-羥-3，5-二氯苯磺酸等和4-氨基安替比林作用，生成紅色素，試劑有一定的自發(fā)氧化，其試劑一般要求試劑吸光度上限≤0.1-0.4。以結(jié)合型硝基苯衍生物作為底物的ALP和GGT常要求≤0.6~0.8。反應(yīng)吸光度向下的試驗取下限值：如以NADH或NADPH為輔酶的ALT和Urea(紫外法)等試驗，一般要求試劑吸光度下限≥1.0。
2.試劑空白速率顧名思義，它是在反應(yīng)過程中對試劑空白的變化速率作連續(xù)監(jiān)測，其數(shù)值在樣品測定結(jié)果中自動扣除。試劑中可能混有的其他雜酶或干擾物對試劑空白速率有影響。在酶促反應(yīng)中，試劑空白速率也是試劑在監(jiān)測過程中底物自發(fā)降解的結(jié)果。底物為還原型輔酶者，本身不穩(wěn)定而分解，多呈下降趨勢；以硝基苯酚或苯胺的衍生物作底物，在堿性環(huán)境中自發(fā)水解成被測物質(zhì)，多呈上升趨勢。此參數(shù)主要用于連續(xù)監(jiān)測法。一般認(rèn)為酶活性測定的試劑空白速率(△A/min)應(yīng)≤0.001~0.003。由于試劑空白速率與儀器檢測下限、正常參考范圍下限等指標(biāo)有關(guān)，有時也以濃度單位表示。要根據(jù)K值、儀器穩(wěn)定性、方法允許變異而定。例如，ALT或AST40U/L以下活力濃度的分析誤差應(yīng)≤10%，其試劑空白速率應(yīng)≤4.0U/L。一些儀器的程序參數(shù)中沒有此參數(shù)，但我們應(yīng)在試劑空白的測定資料中關(guān)注它，若資料波動大，須查找試劑或儀器原因。
3.試劑空白的日常監(jiān)測測定方法設(shè)置了試劑空白的項目，都要先行作試劑空白測定，在樣品測定計算中自動扣除。由于試劑空白不是在每一個樣品測定中實時測定并扣除，當(dāng)樣品測定中試劑的變化在未達(dá)到參數(shù)設(shè)置限值時不易發(fā)現(xiàn)，試劑空白扣除會產(chǎn)生誤差。所以，應(yīng)根據(jù)試劑的穩(wěn)定性確定試劑空白及相關(guān)的校準(zhǔn)的測定頻率。連續(xù)監(jiān)測法的試劑應(yīng)每天(尤其在換另瓶或另批號試劑時)常規(guī)測定此參數(shù)。對樣品的異常結(jié)果.也應(yīng)及時對其測定吸光度資料(包括與試劑空白有關(guān)的資料，例如PO點讀數(shù))觀察分析。
4.有的半自動生化儀沒有試劑吸光度上限和下限設(shè)定，但一般在測定屏幕都顯示初始吸光度值，應(yīng)人工加以判斷。酶活力測定結(jié)果呈負(fù)值，有時可能與試劑空白錯誤有關(guān)。
5.試劑吸光度上限和下限不是試劑質(zhì)量的指針。因此，一定的校準(zhǔn)頻率和室內(nèi)質(zhì)控是質(zhì)量保證的必需手段。我們在實際工作中就遇到酶活力測定的試劑空白數(shù)據(jù)在規(guī)定限值內(nèi)，但質(zhì)控物測定結(jié)果連續(xù)偏低，病人結(jié)果因每天標(biāo)本少而難以判斷，后發(fā)現(xiàn)是試劑質(zhì)量下降。
五、波長的選擇及測定模式
波長(Wave1ength)的正確選擇有利于提高測定的靈敏度和減少測定誤差。光度學(xué)方法有單波長和雙波長之分，有的儀器可用三波長、甚至多波長，以及兩波長比率等。有的儀器可作導(dǎo)數(shù)光譜分析。單波長測定易受樣品溶血、黃疸、脂濁等因素干擾。雙波長測定可以通過副波長加以修正，減少甚至消除干擾因素，提高測定準(zhǔn)確性。采用同光束雙波長，亦有利于排除光源強(qiáng)度變化對結(jié)果的影響。
1.測定波長選擇有三個主要條件：
(1)待測物質(zhì)在該波長下的光吸收大。
(2)其吸收峰宜較寬而鈍，而不是處于尖峰或陡肩，一般不選光譜中的末端吸收峰，換句話說，該吸收峰處的吸光度隨波長變化較小。
(3)常見干擾物在該波長下的光吸收小。試劑盒說明一般已提供波長參數(shù)。實際波長選擇需要了解待測物質(zhì)和干擾組分對不同波長單色光的吸收程度，即以波長為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)作吸收光譜曲線(光吸收曲線)。
采用透射免疫比濁法，免疫復(fù)合物大小約35~100mn之間，于波長290~410nm下有大吸收峰，常取340nm；如用膠乳增強(qiáng)免疫濁度法，理想的檢測波長可增至可見光區(qū)。
2.雙波長測定當(dāng)待測物質(zhì)與干擾組分的吸收光譜互相重疊、出現(xiàn)非特異光吸收，或因反應(yīng)液混濁出現(xiàn)光散射時，可以采用雙波長(或多波長)測定。雙波長測定的原則是根據(jù)干擾組分和待測物質(zhì)吸收光譜的峰形特征，選擇兩個波長和，使干擾組分在這兩個波長處的吸光系數(shù)相等，而使待測物質(zhì)在兩波長處的吸光系數(shù)有顯著差別。以兩波長分別測定分析溶液的吸光度，以兩個吸光度值之差(△A)計算。雙波長選擇常見：血紅蛋白340nm和380nm波長吸光度相同，以NADH或NADPH作為測定底物或產(chǎn)物的試驗常采用340/380nm；有的也.采用340/405nm。ALP和GGT常使405/476nm，Trinder反應(yīng)多選取520/600nm或550/660nm.免疫比濁常選用340/700nm等。
連續(xù)監(jiān)測法中，要注意雙波長測定有兩種類型的機(jī)型：主波長全程監(jiān)測副波長單點監(jiān)測，和雙波長全程監(jiān)測。不僅因為后者的準(zhǔn)確性優(yōu)于前者，而且因為酶活性測定的K值計算與波長及摩爾吸光系數(shù)有關(guān)，更顯重要。
副波長單點監(jiān)測：試劑和樣品混合后，雙波長只測一點，此后只用主波長連續(xù)監(jiān)測；計算時，全部x主吸光度值均減去同一λ副吸光度值。K值計算代入主波長摩爾吸光系數(shù)即可。機(jī)型如Monarch1000，TechniconRA1000等。
雙波長全程監(jiān)測：全程每～測定點均用雙波長同測，并各自用λ主吸光度值減去λ副吸光度值。因為所測指示酶或產(chǎn)物在λ副波長時也存在一定的吸光系數(shù)，K值計算代入的摩爾吸光系數(shù)值應(yīng)采用ε主減去ε副。如NADH的ε為6.22×10，為1.33×10，ALP產(chǎn)物ε為18.5x×10，ε為0.2×10很??；GGT產(chǎn)物在副波長處無吸光系數(shù)。
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