(一)高層瓊脂柱法

此法很簡(jiǎn)單，只需把含有1%葡萄糖的瓊脂培養(yǎng)基裝至試管的三分之二高度，冷卻凝固后，用接種針穿刺接種至瓊脂底部，培養(yǎng)后厭氧菌在底部生長(zhǎng)，越接近表面越差。也可在滅菌后冷卻至45 ℃左右的瓊脂中，直接用無(wú)菌吸管加入適量的菌懸液，然后迅速用兩手搓轉(zhuǎn)式管使之混勻，再放入冷水中使之凝固。培養(yǎng)后厭氧菌會(huì)在管的深處出現(xiàn)。

(二)黃磷法

在能密封的玻璃容器的底部放少量的水和一塊擱板，培養(yǎng)皿或試管接種完后用紙包好放于擱板上。在容器的上部放一個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿，把碳酸鈣和黃磷放于皿中，用燒紅的接種針引燃黃磷后，立即封閉容器。黃磷燃燒消耗掉容器中的氧，形成無(wú)氧環(huán)境。生成的氧化磷可被水吸收， 1L的容積需用1 g黃磷。

(三)厭氧罐法

1.厭氧罐體的結(jié)構(gòu)

目前使用的厭氧罐的罐體采用透明聚碳酸酯硬質(zhì)塑料或不銹鋼制成。圓形罐蓋的周邊凹槽內(nèi)嵌有橡皮圈，能使罐體和蓋密封。罐體與罐蓋之間有一個(gè)大的金屬螺旋夾，可使罐體密閉。罐體內(nèi)蓋的正中下方，有個(gè)金屬絲網(wǎng)盒或金屬盤，用于放催化劑。

2.厭氧罐的原理

原理是用物理或化學(xué)的方法把密閉容器中的氧除去，制造一個(gè)無(wú)氧環(huán)境。常用的方法是油氣換氣法和氣體發(fā)生袋法。

抽氣換氣法：先把需厭氧培養(yǎng)的平板或液體瓶放入真空厭氧缸或厭氧罐中，再放入鈀粒催化劑(可使罐中的氧與氫反應(yīng)生成水，除去氧)和美藍(lán)指示劑(缸中有氧時(shí)，指示劑為藍(lán)色，缸中無(wú)氧時(shí)，指示劑變無(wú)色),然后利用真空泵對(duì)真空厭氧缸或厭氧罐抽真空，再反復(fù)充入無(wú)氧的氮?dú)?次，后充入80%的氮?dú)狻?0%的氫氣和10%二氧化碳的混合氣體。鈀粒能夠促使混合氣體中氧反應(yīng)掉，美藍(lán)指示劑顯示無(wú)色，則厭氧環(huán)境形成。鈀粒催化劑用過后，經(jīng)干熱2h后可重復(fù)使用。打開觀察培養(yǎng)物后需重新抽氣換氣。

 該法的特點(diǎn)是只利用化學(xué)方法造成無(wú)氧環(huán)境，簡(jiǎn)便易行。該方法是在厭氧罐中放一個(gè)氫氣、二氧化碳?xì)怏w發(fā)生袋、催化劑、美藍(lán)指示劑。在鈀粒催化劑的作用下，罐中的氧氣和氫氣反應(yīng)生成水，從而造成罐內(nèi)的無(wú)氧環(huán)境。氣體發(fā)生袋是由一丸氯化鈷合劑、一丸碳酸氫鈉檸檬酸合劑及一片濾紙條組成。使用時(shí)剪去部分的一角，加入10 mL水，水沿濾紙滲到兩個(gè)試劑丸上，發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生氫氣和二氧化碳。

使用時(shí)，加水后應(yīng)立即放入罐中并密閉，即可厭氧培養(yǎng)。

(四)厭氧袋法

厭氧袋是一種無(wú)毒、透明不透氣的復(fù)合塑料薄膜袋。袋中裝有產(chǎn)生氫氣和二氧化碳的安剖瓶1只，已還原成無(wú)色的美藍(lán)指示劑安剖瓶1只和鈀催化劑。使用時(shí)，把需培養(yǎng)的平皿放入?yún)捬醮?，用彈簧夾夾緊袋口，呈密閉狀態(tài)，先折斷氣體發(fā)生安瓿瓶，反應(yīng)結(jié)束后(0.5 h左右),再折斷美藍(lán)指示劑安瓿瓶，若指示劑不顯色，則可進(jìn)行培養(yǎng)。

現(xiàn)在，出現(xiàn)了一種更為方便的厭氧藥劑袋，只需把藥劑(產(chǎn)氣袋)外包裝剪開放入袋(盒或罐)內(nèi)(見下圖),密封后即可形成適宜的厭氧環(huán)境。藥劑袋分厭氧培養(yǎng)、微需氧培養(yǎng)和嗜二氧化碳培養(yǎng)三種類型。*厭氧可同時(shí)放置指示劑。此法操作更加簡(jiǎn)便，不用加水、不用催化劑。厭氧產(chǎn)氣袋反應(yīng)30 min后氧氣濃度降為0;微需氧產(chǎn)氣袋反應(yīng)后達(dá)到氧氣濃度8%-9% ,二氧化碳濃度7%~8%;二氧化碳產(chǎn)氣袋反應(yīng)后達(dá)到氧氣濃度15%左右，二氧化碳濃度6%左右。

(五)培養(yǎng)箱法

對(duì)高度厭氧菌的培養(yǎng)，用上面的介紹方法難以達(dá)到要求，需使用專門的厭氧培養(yǎng)箱。厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)充滿氮?dú)?、氫氣、二氧化碳的混合氣體，通過箱上帶的橡膠手套，可以使所有的操作都能在箱內(nèi)進(jìn)行。

(六)氧化酶法和氧化酶平板法

氧化酶法是在氧化酶平皿中，先將0. 1 ml.的氧化酶加入到5mL的肉汁培養(yǎng)基中，再倒入?yún)捬跖囵B(yǎng)基混合，當(dāng)培養(yǎng)基處于融化狀態(tài)時(shí)即加入?yún)捬蹙?。因皿蓋內(nèi)有一個(gè)內(nèi)環(huán)，它與平板表面形成一個(gè)牢固的密封環(huán)境，氧化酶可還原培養(yǎng)基中瓊脂表面和蓋子之間的空間氧。

氧化酶平板法是先在氧化酶平皿中放入傳統(tǒng)的厭氧培養(yǎng)基和少量的氧化酶制劑制成平板，使用時(shí)，直接進(jìn)行劃線接種，在有氧的條件下培養(yǎng)即可。

(七)焦性沒食子酸法

1. Wright管法

Wright管法(見圖4-2)可用于嚴(yán)格的厭氧菌培養(yǎng)。原理是焦性沒食子酸與氫氧化鈉溶液反應(yīng)，吸收斜面與棉塞間的氧氣。方法是在Wright管的斜面上劃線接種厭氧菌后，將培養(yǎng)管口的棉塞修剪后用玻璃棒推入管內(nèi)，使它剛好在斜面的上方，再在棉塞的上方和管口空間內(nèi)填焦性沒食子酸結(jié)晶，再加入1 ml 10%氫氧化鈉溶液，后在管口塞上橡皮塞，立即倒置，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2. Buchner管法

Buchner管是一個(gè)厚壁的玻璃管，它的下端變細(xì)，使裝入的試管不能到達(dá)底部，管口有橡皮塞可使管密封 培養(yǎng)時(shí)先在管的底部加入少許的焦性沒食子酸，然后加入氫氧化鈉溶液和接種好的試管，立即用橡皮塞封住管口，再放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)即可。焦性沒食子酸和氫氧化鈉的用量是100 mL的容積用1 g焦性沒食子酸和5 mL 20%氫氧化鈉溶液。

3.干燥器法

真空干燥器的構(gòu)造如圖4-3,在隔板下放一個(gè)培養(yǎng)皿底蓋，蓋中加入5 ml. 10%氫氧化鈉(或2. 5 ml. 20%氫氧化鈉或50%過飽和氫氧化鈉),在蓋上方放置一塊載玻片，玻片上放0.5 mg焦性沒食子酸。把需要培養(yǎng)的試管(或培養(yǎng)皿)和一瓶美藍(lán)試劑放在隔板上，然后蓋上干燥器的蓋子(邊緣涂抹少量的凡士林)上，密封好。稍微傾斜干燥器，使焦性沒食子酸與氫氧化鈉混合，吸收氧氣，同時(shí)打開與干燥器連接的真空泵，抽出干燥器中的空氣，即可放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(八)除氧法Hungate厭氧技術(shù)

Hungate厭氧技術(shù)是美國(guó)微生物學(xué)家R. E. Hungate于1950年發(fā)明的一套用于厭氧菌分離和培養(yǎng)的嚴(yán)格的厭氧技術(shù)，它包括培養(yǎng)基預(yù)還原和在無(wú)氧環(huán)境中進(jìn)行的菌株分離和培養(yǎng)操作技術(shù)。除氧法Hungate厭氧技術(shù)的原理是利用除氧銅柱制備高純氮，來(lái)驅(qū)除小環(huán)境中的空氣，使整個(gè)操作過程從培養(yǎng)基的配制、分裝、滅菌，以及菌懸液的稀釋、接種、培養(yǎng)、分離、移種至保蔽笙卻外干高度無(wú)氧的條件進(jìn)行，從而保證嚴(yán)格厭氧菌的存活和生長(zhǎng)。

1.銅柱除氧系統(tǒng)的原理

銅柱是由內(nèi)部裝有銅絲或銅屑的硬質(zhì)玻璃管構(gòu)成，長(zhǎng)約40 mm ~400 mm,兩段被加工成漏斗狀，外壁繞有加熱層，通過與變壓器相連來(lái)控制電壓和穩(wěn)定銅柱的溫度。銅柱兩端用膠管一端連接氣鋼瓶，一端連接出氣管口。當(dāng)從氣鋼瓶出來(lái)的氣體如氮?dú)?、二氧化碳和氫氣等含有微量氧氣時(shí)，這些氣體通過溫度約360 ℃的銅柱時(shí)，銅和氣體中的微量氧氣化合生成氧化銅，而氧化銅又被還原成了銅，銅柱則又呈現(xiàn)明亮的黃色。此銅柱可以反復(fù)使用，并不斷起到除氧的目的。

2.預(yù)還原培養(yǎng)基及稀釋液的制備

先將配制好的培養(yǎng)基和稀釋液煮沸驅(qū)除氧氣，而后用半定量加樣器趁熱分裝到螺口厭氧試管中，一般瓊脂培養(yǎng)基裝4.5 mlL ~5 mL,稀釋液裝9 ml,同時(shí)插入通氮?dú)獾拈L(zhǎng)針頭以排除氧氣，直至培養(yǎng)基內(nèi)加入的氧化還原指示劑-刃天青由藍(lán)到紅后變成無(wú)色，證明試管內(nèi)氧氣已被*去除，再蓋上螺口的丁烯膠塞及螺蓋，滅菌。

3.樣品不同稀釋度的制備

在無(wú)菌條件下準(zhǔn)確稱取1g固體或用無(wú)菌注射器吸取1 mL混合均勻的液體樣品，而后加入按此操作方法依次進(jìn)行10倍系列稀釋，制成不同濃度的樣品稀釋液。選適宜的三個(gè)稀釋度進(jìn)行試管培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

4.厭氧滾管培養(yǎng)法

將盛有無(wú)氧無(wú)菌瓊脂培養(yǎng)基的試管加熱至100 ℃，使瓊脂熔化，并保溫在50 ℃左右的水浴中，備用。用無(wú)菌注射器取至少3個(gè)稀釋度的樣品稀釋液0.1 mL,加入盛有融化的預(yù)培養(yǎng)基在試管內(nèi)壁立即凝固成一薄層。適溫培養(yǎng)后，在瓊脂層內(nèi)或表面形成肉眼看見的菌落。移種挑取單菌落時(shí)，將帶有單菌落的試管和需接種的盛有無(wú)菌、厭氧培養(yǎng)液的試管固定在適當(dāng)?shù)闹Ъ苌?，去掉試管的膠塞，同時(shí)插入用火焰滅過菌的注射器氮?dú)忾L(zhǎng)針頭，通入氣流速度適當(dāng)?shù)?、無(wú)菌的高純氮?dú)狻⑻艟涞臒o(wú)菌彎頭毛細(xì)管的粗口端接一約60 cm長(zhǎng)的乳膠

管，小心插入形成單菌落的試管內(nèi)，用嘴咬住膠管的另一端，輕輕吸取待取的單菌落，轉(zhuǎn)移至盛有厭氧培養(yǎng)液的試管內(nèi)，塞上膠塞，擰緊螺口膠木蓋，適溫培養(yǎng)。

5.活菌（分離）計(jì)數(shù)

選擇分散均勻，數(shù)量在幾十至幾百個(gè)菌落的厭氧試管進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，即可得出每克或每毫升樣品中含有的厭氧菌的數(shù)量。

6.計(jì)算

活菌數(shù)量CFU/g( mL)樣品=0. 1 ml滾管計(jì)數(shù)的實(shí)際平均值x 10 x稀釋倍數(shù)。