1. 簡介
搖瓶的使用對動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)越來越重要。以下各種搖瓶中培養(yǎng)CHO（中國倉鼠卵巢）細(xì)胞的示例表明，Multitron細(xì)胞培養(yǎng)搖床（INFORS HT，CH Bottmingen）非常適合種子液的生產(chǎn)。

CHO細(xì)胞系是生物技術(shù)中常用的細(xì)胞系。為了生產(chǎn)用于接種的種子培養(yǎng)液和生產(chǎn)SEAP蛋白，使用了CHO-XM-111細(xì)胞株。瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院 M.Fussengerger 教授的團(tuán)隊(duì)用編碼重組蛋白SEAP（分泌型堿性磷酸酶）基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染該細(xì)胞株，并使用由四環(huán)素控制的啟動(dòng)子PhCMV-1。表達(dá)載體的使用使得通過啟動(dòng)子可選擇性表達(dá)兩個(gè)基因成為可能。這樣就可以生產(chǎn)SEAP蛋白，包括非生產(chǎn)性的生長階段，和基于無四環(huán)素培養(yǎng)基交換的增殖抑制生產(chǎn)階段。

2. Multitron 技術(shù)參數(shù)
*  50 mm 振幅 (可選25mm)
*  通氣 空氣和  CO2 (0 – 20% asstandard)
*  蒸汽濕度套件（可選）
*  不同可選托盤 (一次培養(yǎng)袋托盤, 粘性托盤，通用托盤等)
*  其他選項(xiàng) (制冷, 去污, ShakerBag等)

3. 實(shí)驗(yàn)條件
為了在生物反應(yīng)器中生產(chǎn)種子培養(yǎng)液（作為后期培養(yǎng)的接種物）和SEAP，使用CHO-XM-111細(xì)胞系，無血清和無蛋白的HP-1培養(yǎng)基（Cell Culture Technologies GmbH）在250 mL、500 mL和1000mL搖瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)基中添加2g/L Pluronic F-68（Sigma）和2.5 mg/L 四環(huán)素（Sigma）。設(shè)置溫度37℃，濕度85% 和5%的CO2飽和度。所有搖瓶以恒定的122 rpm轉(zhuǎn)速在Multitron（INFORS-HT, CH-Bottmingen）中培養(yǎng)。

4. 批次補(bǔ)料振蕩培養(yǎng)
采用不同體積的搖瓶和相應(yīng)的補(bǔ)料策略。

a) 在250ml搖瓶中的培養(yǎng)過程按照以下模式進(jìn)行：

最大比生長速率μmax為0.048 h-1，倍增時(shí)間td =14.4h。

圖1: Multitron

b) 在500ml搖瓶中的培養(yǎng)過程按照以下模式進(jìn)行：

最大比生長速率μmax為0.024 h-1，倍增時(shí)間td =28.9h。

c) 在1000ml搖瓶中的培養(yǎng)過程按照以下模式進(jìn)行：

最大比生長速率μmax為0.044 h-1，倍增時(shí)間td =15.65h。

d) 蒸汽加濕
為了檢測每日液體損失，使用125 mL搖瓶，工作體積為15 mL、20 mL和25 mL，在溫度為37°C，濕度為85% rH的培養(yǎng)前后測定總體積。

5. 分析
a)  參數(shù)分析
每天使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器yc100（Chemotec）測定活細(xì)胞濃度。使用Bioprofile Analyzer 100 Plus（Nova Biomedical）完成生長和生產(chǎn)基質(zhì)的分析

b)公式                                                                                                                   
對于最大生長速率μmax和倍增時(shí)間td的計(jì)算，使用以下公式。

6. 結(jié)果分析
為了優(yōu)化CHO種子液培養(yǎng)，在Multitron細(xì)胞培養(yǎng)搖床中設(shè)置了三個(gè)不同體積的搖瓶（250ml、500ml和1000ml）。在培養(yǎng)CHO-XM-111細(xì)胞的同時(shí)，每天取樣檢測，從而可以**地比較細(xì)胞濃度、底物消耗和緩沖液。

對比最大細(xì)胞濃度表明，500ml 搖瓶中的培養(yǎng)物每毫升可產(chǎn)生4.65×106個(gè)細(xì)胞。在所有培養(yǎng)物中，6天內(nèi)可達(dá)到98%以上的存活率。通過優(yōu)化補(bǔ)料策略，種子培養(yǎng)可在2天后進(jìn)行，最多5天（圖2）。

圖2：對比細(xì)胞濃度和活力

葡萄糖和谷氨酰胺的消耗量，尤其在500mL搖瓶中，表明底物在第五天之前是足夠的，因此補(bǔ)料可防止底物限制（圖3）.

圖3：對比葡萄糖和谷氨酰胺

已知同時(shí)形成銨，乳酸和谷氨酸可降低細(xì)胞生長速率。在所有培養(yǎng)物中，在培養(yǎng)的第五天也觀察到亞臨界濃度的銨。此外，通氣和連續(xù)供應(yīng)5％的CO?可以為培養(yǎng)系統(tǒng)提供**緩沖，因此也可以提供合適的pH條件（圖4）。

圖4:比較銨的含量，谷氨酸鹽，乳酸和pH

直接蒸汽加濕對培養(yǎng)基損失有重要影響，同時(shí)也會改變滲透壓。
特別是在小工作體積下，一天的最大蒸發(fā)量小于0.4%。

圖5:125mL揮發(fā)量

搖瓶的工作體積對氧交換有很大影響，不應(yīng)超過搖瓶最適工作體積。

7. 總結(jié)

培養(yǎng)2-5天后，細(xì)胞總數(shù)達(dá)到1.8 x 10?和1.4 x 10?之間。它可用作2.5L生物反應(yīng)器的接種物，活細(xì)胞濃度約為每毫升5×10?。
接種細(xì)胞密度和細(xì)胞活力越高，培養(yǎng)過程中細(xì)胞密度越高。
盡早更換培養(yǎng)基
在較小接種量和補(bǔ)料策略允許的情況下，可額外補(bǔ)充細(xì)胞培養(yǎng)營養(yǎng)物質(zhì)。另一方面，培養(yǎng)液被稀釋，因此有毒產(chǎn)物減少。
在85%相對濕度條件下，蒸發(fā)量小于0.5%，可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的滲透壓和工藝再現(xiàn)性。

搖瓶培養(yǎng)可用于進(jìn)一步的工藝步驟，例如接種生物反應(yīng)器或一次性袋。