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          干貨分享--WB實(shí)驗(yàn)問題總結(jié)與處理方案(三)

          來源:西安昊興生物科技有限公司   2021年07月27日 15:22  

          41、跑電泳的時(shí)候配的膠總是“縮”是什么原因呢?是有的成分不對嗎?

          答:沒什么問題,就是你膠里的水分被蒸發(fā)了。過夜時(shí)拿保鮮膜包起來,在里面加點(diǎn)水保持濕度就可以了;也可能母液(30%聚丙酰胺)有問題,你可以重新配制一份觀察;能夠替換的試劑,盡量換一下,選用好的試劑。

           

          42、蛋白質(zhì)的分子量跨度很大,如要分離小21KD,中至66KD,大至170KD,可以一次做好嗎?

          答:這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移,一般建議:21kd66kd可以一起轉(zhuǎn),12SDS-PAGE, 濕轉(zhuǎn)120mA, 45-60min就可以了, 可以根據(jù)你實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)調(diào)節(jié);170kd 7%SDSPAGE200mA 90-120min。

           

          43、不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上, 轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決?

          答:可以考慮:轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇(是指終濃度),因?yàn)榧状伎山档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率,但可增加蛋白質(zhì)和PVDF膜的結(jié)合能力,甲醇可以防止凝膠變形,甲醇對高分子量蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn)移時(shí)間;轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS,也是為了增加轉(zhuǎn)移效率;用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜,或使用小孔徑的PVDF膜(0.2微米)。

           

          44、我用的是可視marker,但是電泳總跑不全8條帶,請問什么原因?怎樣改善?膠用過8%,10%,12%,都是這樣。marker是新買的。

          答:一般來說,是小分子量Marker跑走了,增加膠濃度或減少電泳時(shí)間試試看。當(dāng)然梯度膠也是不錯(cuò)的選擇。

           

          45、是否Western Blot實(shí)驗(yàn)半定量一定要加ACTIN內(nèi)參?

          答:半定量實(shí)驗(yàn)需要有內(nèi)參。

           

          46、核內(nèi)抗原Western Blot內(nèi)參選擇什么合適?

          答:可以選用組蛋白,組蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)是很穩(wěn)定的,有很多都可以當(dāng)成內(nèi)參,在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內(nèi)參。

           

          47、做半定量Western Blot,內(nèi)參β-actin,GAPDH哪個(gè)好?

          答:兩者均可。

           

          48、想問一下細(xì)胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時(shí)有什么原則嗎?受不受組織來源的影響?胞膜和胞漿有區(qū)別嗎?

          答:一般來說提取時(shí)加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了,操作時(shí)保持低溫。除非有文獻(xiàn)特別指明用特殊的方法,一般來說都沒有區(qū)別。

           

          49、轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉液是5%TBST脫脂奶粉”,其中TBST最后那個(gè)TTween嗎,濃度多大?

          答:是Tween,配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), NaCl8g, Tris base2.42g 加水 800ml溶解, 500-1000ul Tween-20, HCl 調(diào)節(jié)pH 7.4, 加水定容至 1L

           

          50、封閉,一抗,二抗時(shí)的溫度有沒有什么規(guī)定呢,比如在室溫里做,或者要在4度下?

          答:均可在室溫進(jìn)行,如果時(shí)間不夠,一抗孵育可以先在室溫進(jìn)行一個(gè)小時(shí),然后4度過夜。

           

          51、請問一下PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么?

          答:一般而言,硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián),這樣的話,反復(fù)洗幾次后,蛋白容易掉下來,結(jié)果較差。PVDF膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合,同時(shí)也有疏水作用,但相對較弱。這樣的話,PVDF膜和蛋白接合較牢,不易脫落,結(jié)果較好。

           

          52、怎樣才能把膠跑的非常漂亮,泳道都能很直,上樣的量和灌膠是否很重要,電壓有什么要求?

          答:影響跑膠跑的質(zhì)量,有以下幾個(gè)因素:

          1)電壓,小的電壓會使膠的分子篩效應(yīng)得到充分發(fā)揮。電壓越小,條帶越漂亮,濃縮膠55v,分離膠75v就能跑得很好。

          2)膠的均勻度,膠越均勻,條帶越窄,分離越均勻。倒膠之前,一定要充分混勻,玻璃板一定要干凈,雙蒸水隔離時(shí),一定要比較輕地加上去,避免稀釋上層的分離膠.

           

          53、為什么提高大分子量蛋白的轉(zhuǎn)移的時(shí)候,小分子量蛋白會丟失一些哪?什么原因?

          答:小分子的蛋白在轉(zhuǎn)移過程中,會透過膜去,所以大分子的上去以后,有一部分小分子的就透過去了。

           

          54.電泳中常出現(xiàn)的一些現(xiàn)象:

          ●︶ 條帶呈笑臉狀

          原因:凝膠不均勻冷卻,中間冷卻不好; 電泳系統(tǒng)溫度偏高。

          ●︵ 條帶呈皺眉狀

          原因:可能是由于裝置不合適,特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡,或者兩邊聚合不*。

          ●拖尾

          原因:樣品溶解不好。

          ●紋理(縱向條紋)

          原因:樣品中含有不溶性顆粒。

          ●條帶偏斜

          原因:電極不平衡或者加樣位置偏斜。

          ●條帶兩邊擴(kuò)散

          原因:加樣量過多。

           

          55Western blot結(jié)果中背景較高

          可能的原因及建議:

          ●膜封閉不夠

          延長封閉的時(shí)間;選擇更加適合的封閉液。

          ●一抗稀釋度不適宜

          對抗體進(jìn)行滴度測試,選擇最適宜的抗體稀釋度。

          ●一抗孵育的溫度偏高

          建議4℃結(jié)合過夜。

          ●選擇的膜容易產(chǎn)生高背景

          一般硝酸纖維素膜的背景會比PVDF膜低。

          ●膜在實(shí)驗(yàn)過程中干過

          實(shí)驗(yàn)過程中要注意保持膜的濕潤。

          ●檢測時(shí)曝光時(shí)間過長

          減少曝光時(shí)間。

           

          56Western blot結(jié)果中雜帶較多

          可能的原因及建議:

          ●目的蛋白有多個(gè)修飾位點(diǎn)(磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、乙酰化位點(diǎn)等),本身可以呈現(xiàn)多條帶。

          查閱文獻(xiàn)或進(jìn)行生物信息學(xué)分析,獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息,通過去修飾確定蛋白實(shí)際大小。

          ●目的蛋白有其它剪切本

          查閱文獻(xiàn)或生物信息學(xué)分析可能性。

          ●樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解

          加入蛋白酶抑制劑;樣本處理時(shí)在冰上操作。

          ●上樣量過高,太敏感

          適當(dāng)減少上樣量。

          ●一抗特異性不高

          重新選擇或制備高特異性的抗體。

          ●一抗不純

          純化抗體

          ●一抗或者二抗?jié)舛绕?/span>

          降低抗體濃度。

           

          57 . Western blot結(jié)果中無信號或顯示信號弱

          可能的原因及建議:

          ●檢測樣本不表達(dá)目的蛋白

          選擇表達(dá)量高的細(xì)胞作為陽性對照,用于確定檢測樣本是否為陰性。

          ●檢測樣本低表達(dá)目的蛋白

          提高上樣量,裂解液中注意加入蛋白酶抑制劑。

          ●轉(zhuǎn)移不*或過轉(zhuǎn)移

          可以用麗春紅染膜并結(jié)合染膠(考馬斯亮藍(lán))后確定條帶是否轉(zhuǎn)至膜上或轉(zhuǎn)移過頭;適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時(shí)間和電流。

          ●抗體不能識別測試種屬的相關(guān)蛋白

          購買抗體前應(yīng)當(dāng)認(rèn)真閱讀抗體說明書,確定其是否能夠交叉識別測試種屬的對應(yīng)蛋白。

          ●一抗孵育時(shí)間不足

          建議4℃結(jié)合過夜。

          ●二抗與一抗不匹配

          選擇針對一抗來源的種屬的抗體。

          ●洗膜過度

          洗膜時(shí)間不宜過長,加入的去垢劑不宜過強(qiáng)或過多,建議使用0.1%的弱去垢劑Tween-20。

           

          58. 其它現(xiàn)象:

          ●膜上多處出現(xiàn)黑點(diǎn)或黑斑

          原因:抗體與封閉試劑發(fā)生非特異性的結(jié)合。

          ●反白(條帶顯白色)

          原因:目的蛋白含量太高或者一抗?jié)舛绕摺?/span>

          ●蛋白分子量偏低或偏高

          原因:膠濃度不適合,高分子量要用低濃度膠;小分子蛋白要用高濃度膠。

           

          59.安全問題:

          操作有毒試劑時(shí),帶手套,且操作揮發(fā)性試劑應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。


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