高速逆流色譜相較于中低壓色譜經(jīng)常用于粗提而言，高效液相色譜和高速逆流色譜都可以用于物質(zhì)的精細分離，無論是把多種混合物逐一分開還是單純的要提高某一種物質(zhì)的純度。

對于一種新的待分離提純的物質(zhì)來說，無論是采用高效液相色譜還是采用高速逆流色譜，都需要借鑒已有的經(jīng)驗摸索出適合該物質(zhì)分離的方法，之后，將確定好的分離工藝放大到工業(yè)生產(chǎn)級別的制備型設(shè)備上，進行多次分離、批量生產(chǎn)。

那么，如何保證自動連續(xù)運行時，每個循環(huán)的分離都能得到同樣的結(jié)果就變得至關(guān)重要，否則，哪怕某一單次分離中發(fā)生小的時間漂移都會造成生產(chǎn)上整批分離結(jié)果的污染。

對于使用高效液相的分離來說，要保證分離一致性，會涉及到幾個相關(guān)因素的影響：分離柱、流動相、壓力、溫度、填料情況等。

而采用高速逆流色譜分離時，因無需填料，固定相使用可回收反復(fù)使用的溶劑，所以影響分離一致性的因素相對較少。

高速逆流色譜分離過程中，物質(zhì)的出峰時間可以通過以下公式進行估算：

其中，V_C 是分離柱的體積， F 是流動相流速， Sf 是固定相保留率 （即體系平衡后剩余固定相與分離柱體積的比例）， D 是分配系數(shù)（物質(zhì)分別在固定相和流動相中溶解度的比例）。

從上述這個公式可以看出，要保證多次分離一致性，至少要保證以下幾個因素在分離過程中要保持不變：

1)       柱體積

2)       流動相流速

3)       分配系數(shù)

4)       固定相保留率

其中，柱體積取決于分離時所用的高速逆流色譜系統(tǒng)，一旦設(shè)備確定，該體積也就固定不變。

流動相流速取決于分離時所設(shè)定的泵速參數(shù)。

分配系數(shù)取決于所選用的溶劑體系和溫度。如果分離過程中系統(tǒng)的溫度變化比較大，則可能引起分配系數(shù)的變化。

固定相保留率取決于多個因素，諸如分離轉(zhuǎn)速，溶劑體系構(gòu)成等。實際分離過程中，如果轉(zhuǎn)速不穩(wěn)定，則會帶來固定相保留率的變化。

從上述分析可見，設(shè)備的穩(wěn)定性（轉(zhuǎn)速一致，溫度一致，管路堅固不漏液等）是保證分離效果的首要條件。其次，溶劑體系的穩(wěn)定性也很重要，如果根據(jù)一定配比配置好的上/下相溶劑因較長時間放置而出現(xiàn)揮發(fā)現(xiàn)象，也會導(dǎo)致分離體系的實際構(gòu)成發(fā)生變化，從而對分離一致性產(chǎn)生影響。

除此之外，待分離物質(zhì)每單次分離時的上樣體積和濃度是否*相同，也是確保連續(xù)、批次生產(chǎn)分離結(jié)果一致性的因素之一。例如：采用手動上樣方法時，很可能會因為人工操作過程中難免出現(xiàn)的差異性，導(dǎo)致每次所上樣的體積不能*保持等量，其結(jié)果必然會出現(xiàn)出峰時間的變化。

為此，對于高速逆流色譜的多次分離過程來說，要保證多次分離的一致性，可以從以下幾個方面來保證：

1. 高速逆流色譜設(shè)備：選用比較穩(wěn)定可靠的高速逆流色譜設(shè)備，能夠精確控制分離轉(zhuǎn)速，精確控制分離溫度，液體管路沒有漏液風(fēng)險。

2. 上樣：選用自動上樣系統(tǒng)，保證分離時灌入同樣體積的固定相和樣品。

3. 泵：選用流速穩(wěn)定的泵。

4. 溶劑配置：在多次分離開始前一次性配置好足夠量的固定相和流動相，對于可能揮發(fā)的溶劑，應(yīng)采用有蓋或密封性好的容器進行存放，盡量不要把溶劑暴露在高溫環(huán)境中。

5. 樣品溶液配置：選用溶解度較好的一相作為溶劑來溶解待分離物質(zhì)，在多次分離開始前一次性配置好足量的待分離物質(zhì)溶液。確保樣品*溶解，防止長時間放置出現(xiàn)沉淀等改變上樣濃度的變化，建議可采用攪拌裝置對樣品溶液進行持續(xù)攪拌。

6. 自動化操作：采用自動化控制軟件進行批量處理。通過軟件實現(xiàn)自動泵入固定相/樣品/流動相，以及各目標化合物組分的收集、排廢等過程，規(guī)避人為因素導(dǎo)致的失誤發(fā)生，通過軟件設(shè)定分離方法，自動完成連續(xù)、不停機、多次的分離生產(chǎn)。

以下以江陰逆流科技有限公司的Superchrome-1L系統(tǒng)分離某天然產(chǎn)物粗提物為例。

該應(yīng)用案例中的主要參數(shù)如下：

主機轉(zhuǎn)速：1200RPM，溫度：30℃，轉(zhuǎn)向：正向

固定相：正庚烷：甲醇：水 以一定比例混合靜置得到的上相溶液

流動相：正庚烷：甲醇：水 以一定比例混合靜置得到的下相溶液

樣品：30mL

流動相流速：20mL/min

   采用江陰逆流科技有限公司配套的逆流專用控制軟件創(chuàng)建方法，分別連續(xù)分離2次分離以及連續(xù)分離17次所得到的圖譜如下所示：

從以上兩個圖譜可以看出，無論是連續(xù)2次分離，還是17次分離，高速逆流色譜分離的出峰時間，峰高，峰型都非常一致。

        如果是類似上述案例中的物質(zhì)，每次出峰保持穩(wěn)定一致性的情況下，用戶可選擇在軟件上對不同閥門的切換時間進行設(shè)定即可實現(xiàn)所要組分的收集。

        如果用戶在實際操作多次分離過程時，因某種特定原因?qū)е挛茨鼙ＷC諸如溶劑體系，樣品溶液濃度等某種因素的一致性，則可能造成分離結(jié)果的變化，其現(xiàn)象為分離得到的峰型相近，但是出峰時間會出現(xiàn)前后短暫的漂移，這種情況下，如果單純通過時間區(qū)間進行閥門切換來收集組分就會造成不同組分的混合，而導(dǎo)致批量分離事故的發(fā)生。

而單純的定峰模式對于逆流色譜分離常見的多雜質(zhì)，多雜峰的分離結(jié)果來說為了避免組分漏接就必須設(shè)定并接收冗余的雜質(zhì)峰。為此，江陰逆流科技有限公司開發(fā)的逆流專用控制軟件除了提供常規(guī)定時、定峰收集模式外，還提供了一個按照時間區(qū)間的定峰收集模式。該模式可以實現(xiàn)當系統(tǒng)出現(xiàn)較小的出峰時間漂移情況下也能夠準確的對組分進行收集。

        該模式下，組分收集的開始時間通過三方面因素綜合判斷進行確定：時間區(qū)間，峰高，最小保持時間。當檢測器的輸出在時間區(qū)間內(nèi)達到設(shè)定高度，且保持時間大于設(shè)定的最小保持時間后，系統(tǒng)自動切換輸出收集閥門，開始新組分收集。

        該模式下，組分收集的停止時間的確定因素同樣由三個因素確定：時間區(qū)間，峰高，最小保持時間。當檢測器的輸出在時間區(qū)間內(nèi)降低到設(shè)定高度，且保持時間大于設(shè)定的最小保持時間時，系統(tǒng)自動切換輸出收集閥門，停止該組分收集。

        該模式的設(shè)定方式如下圖所示：

綜上所述，多次高速逆流分離結(jié)果的一致性，可以從設(shè)備，軟件，操作過程等多個維度來加以保證。