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數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)技巧攻略
數(shù)字PCR(DigitalPCR)技術(shù)作為新一代核酸檢測(cè)和定量技術(shù)，目前在痕量核酸樣本檢測(cè)、復(fù)雜樣本稀有突變檢測(cè)和微小表達(dá)差異鑒定等方面表現(xiàn)出的優(yōu)勢(shì)已被普遍認(rèn)可。NGS和CRISPR等分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為數(shù)字PCR技術(shù)在microRNA研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、致病微生物鑒定、轉(zhuǎn)基因成分鑒定及基因細(xì)胞治療等諸多領(lǐng)域帶來(lái)了新的契機(jī)?；谶@一功能強(qiáng)大的新技術(shù)，如何獲得更理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果呢?下面且聽(tīng)小Q娓娓道來(lái)。
引物優(yōu)化設(shè)計(jì)
良好的引物探針設(shè)計(jì)是數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)獲得成功的關(guān)鍵因素之一。這正是眾多研究人員選擇LNA（鎖核酸技術(shù)）的原因——LNA修飾的引物和探針采用了成熟可靠的算法設(shè)計(jì)，獲得了科學(xué)家的信賴。
使用不合適的引物可能會(huì)引入引物二聚體、非特異性擴(kuò)增等，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。在此，小Q建議您在設(shè)計(jì)引物時(shí)需做以下幾個(gè)方面的檢查，需對(duì)設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，以確保引物的特異性！
在數(shù)字PCR定量實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于基因突變檢測(cè)、基因表達(dá)差異分析和拷貝數(shù)變異鑒定等對(duì)實(shí)驗(yàn)性要求較高的實(shí)驗(yàn)，需要特異性更高的Assay。QIAGEN基于QIAcuity數(shù)字PCR平臺(tái)開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了針對(duì)上述常見(jiàn)應(yīng)用的700多組dPCRLNAAssay，所有Assay均經(jīng)過(guò)鎖核酸修飾來(lái)增強(qiáng)其對(duì)互補(bǔ)序列的親和力和特異性，進(jìn)而提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
鎖核酸技術(shù)優(yōu)勢(shì)
樣品制備
值得注意的是，在gDNA長(zhǎng)度≥20kb或進(jìn)行拷貝數(shù)變異檢測(cè)實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須對(duì)樣品進(jìn)行酶切處理，確保大片段DNA序列或串聯(lián)序列在酶切處理后，模板隨機(jī)且均勻的進(jìn)入獨(dú)立反應(yīng)體系，以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確和精確的定量。
建議酶切位點(diǎn)
數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)離不開(kāi)包含有Mg2+、dNTP、Buffer和DNA聚合酶等PCR反應(yīng)所需要的MasterMix。隨著實(shí)驗(yàn)的不斷深入，對(duì)于實(shí)驗(yàn)條件的要求也不斷提高，其中DNA聚合酶對(duì)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性起著至關(guān)重要的作用。由于非熱啟動(dòng)的DNA聚合酶在反應(yīng)體系易使引物在室溫條件下發(fā)生非特異性擴(kuò)增，直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。為確保實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，QIAcuityEGPCRKit和ProbePCRKit均采用抗體修飾的熱啟動(dòng)DNA聚合酶，利用小分子鎖扣(Guardmolecular)將DNA聚合酶與抗體緊密結(jié)合形成雙保險(xiǎn)，使其室溫條件下失活，只有通過(guò)95℃高溫2分鐘才能開(kāi)啟小分子鎖扣，激活DNA聚合酶活性，有效避免了非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象。
熱啟動(dòng)DNA聚合酶技術(shù)
樣品分區(qū)微反應(yīng)單元體積大小一致且穩(wěn)定是泊松分布準(zhǔn)確計(jì)算的前提。樣本反應(yīng)液在進(jìn)行液滴分散過(guò)程中由于液體表面張力、操作不當(dāng)?shù)扔绊?，?dǎo)致其部分發(fā)生融合和破裂。融合使液滴體積變大，破裂則導(dǎo)致有效分區(qū)數(shù)量變少更增加了交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。因此，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程需嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。相較于液滴式分區(qū)，QIAcuity數(shù)字PCR搭配的Nanoplate采用納米微孔設(shè)計(jì)，利用微流體技術(shù)將數(shù)字PCR反應(yīng)體系分配到大小均一且固定微孔中，并在分區(qū)完成后自動(dòng)封閉所有微孔聯(lián)通管道，真正意義上實(shí)現(xiàn)獨(dú)立均一的微反應(yīng)體系。
熱循環(huán)過(guò)程PCR擴(kuò)增效率的高低直接影響終信號(hào)的判讀和實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。在進(jìn)行熱循環(huán)實(shí)驗(yàn)時(shí)，需檢查樣品的密封性以及PCR反應(yīng)板是否和PCR儀熱蓋*接觸，確保PCR過(guò)程中樣品反應(yīng)液沒(méi)有蒸發(fā)。QIAcuity數(shù)字PCR系統(tǒng)采用獨(dú)立的微反應(yīng)腔室封閉方式，固態(tài)的物理分割和封閉可有效避免PCR過(guò)程中微反應(yīng)體系的水分蒸發(fā)，確保微反應(yīng)體系中樣本反應(yīng)液濃度的恒定，更易實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確和精確的定量。
數(shù)據(jù)分析原始數(shù)據(jù)中往往發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)與陰性背景之間存在許多弱陽(yáng)性信號(hào)。因此需要對(duì)引物探針進(jìn)行重新設(shè)計(jì)和優(yōu)化（詳見(jiàn)引物探針優(yōu)化設(shè)計(jì)）或提升退火溫度（探針通常比引物高5~10℃），以消除疑似熒光信號(hào)的“雨區(qū)“現(xiàn)象；此外，陽(yáng)性信號(hào)和陰性背景間隙過(guò)小，導(dǎo)致終結(jié)果無(wú)法準(zhǔn)確判讀。因此需要調(diào)整引物探針濃度（建議總反應(yīng)體系引物濃度為600~800nM；探針濃度為200-400nM）或5'端前三個(gè)堿基如有G出現(xiàn)，則將其互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)為實(shí)驗(yàn)所用探針，以提高陰陽(yáng)性信號(hào)間隙，便于分析結(jié)果的準(zhǔn)確判讀。
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