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實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理技術(shù)及其應(yīng)用
實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)誕生以來，越來越受到實(shí)驗(yàn)室老師的青睞。
熒光定量PCR原理：熒光定量PCR早稱TaqManPCR，后來也叫Real-TimePCR，是美國PE（PerkinElmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。
一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和CT值。
熒光域值（threshold）：是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般熒光域值的缺省設(shè)置是PCR反應(yīng)前3-15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold=10XSDcycle6-15。熒光域值設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。
Ct值：是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
Ct值與起始模板的關(guān)系：研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，Ct值的重現(xiàn)性較好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相對(duì)穩(wěn)定的。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值如下圖所示。
因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
其中：Ct值不是恒定不變的，可以受到不同樣品、不同儀器的影響，即使相同的樣品在相同的儀器上重復(fù)2遍，Ct值也會(huì)存在差異。
熒光定量檢測(cè)：熒光定量檢測(cè)根據(jù)所使用的標(biāo)記物不同可分為熒光探針和熒光染料。熒光探針又包括Beacon技術(shù)（分子信標(biāo)技術(shù)，以美國人Tagyi為代表）、TaqMan探針（以美國ABI公司為代表）和FRET技術(shù)（以羅氏公司為代表）等；熒光染料包括飽和熒光染料和非飽和熒光染料，非飽和熒光染料的典型代表就是現(xiàn)在常用的SYBRGreenⅠ；飽和熒光染料有EvaGreen、LCGreen等。
SYBRGreenI是熒光定量PCR常用的DNA結(jié)合染料，與雙鏈DNA非特異性結(jié)合。在游離狀態(tài)下，SYBRGreenI發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合，其熒光增加1000倍。所以，一個(gè)反應(yīng)發(fā)出的全部熒光信號(hào)與出現(xiàn)的雙鏈DNA量呈比列，且會(huì)隨擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而增加。
雙鏈DNA結(jié)合染料的優(yōu)點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，僅需要2個(gè)引物，不需要設(shè)計(jì)探針，無需設(shè)計(jì)多個(gè)探針即可以快速檢驗(yàn)多個(gè)基因，且能夠進(jìn)行熔點(diǎn)曲線分析，檢驗(yàn)擴(kuò)增反應(yīng)的特異性，低的初始成本，通用性好，因此國內(nèi)外在科研中使用比較普遍。
熒光探針法（Taqman技術(shù)）：PCR擴(kuò)增時(shí)，加入一對(duì)引物的同時(shí)再加入一個(gè)特異性的熒光探針。該探針為一直線型的寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)，探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，PCR儀檢測(cè)不到熒光信號(hào)；PCR擴(kuò)增時(shí)（在延伸階段），Taq酶的5'－3'切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步，這也是定量的基礎(chǔ)所在。
熒光定量PCR的應(yīng)用：
分子生物學(xué)研究:
1.核酸定量分析。對(duì)傳染性疾病進(jìn)行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的檢測(cè),比如近期流行的甲型H1N1流感，轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物基因拷貝數(shù)的檢測(cè)，RNAi基因失活率的檢測(cè)等。
2.基因表達(dá)差異分析。比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異(如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等)，特定基因在不同時(shí)相的表達(dá)差異以及cDNA芯片或差顯結(jié)果的確證
3.SNP檢測(cè)。檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性對(duì)于研究個(gè)體對(duì)不同疾病的易感性或者個(gè)體對(duì)特定藥物的不同反應(yīng)有著重要的意義，因分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)的巧妙性，一旦SNP的序列信息是已知的，采用這種技術(shù)進(jìn)行高通量的SNP檢測(cè)將會(huì)變得簡(jiǎn)單而準(zhǔn)確。
4.甲基化檢測(cè)。甲基化同人類的許多疾病有關(guān)，特別是癌癥，Laird報(bào)道了一種稱作Methylight的技術(shù)，在擴(kuò)增之前先處理DNA，使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響，用特異性的引物和Taqman探針來區(qū)分甲基化和非甲基化的DNA，這種方法不僅方便而且靈敏度更高。
醫(yī)學(xué)研究：
1.產(chǎn)前診斷：人們對(duì)遺傳性物質(zhì)改變引起的遺傳性疾病還無法治療，到目前為止，還只能只能通過產(chǎn)前監(jiān)測(cè)，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發(fā)生，如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)其Y性別決定區(qū)基因是一種無創(chuàng)傷性的方法，易為孕婦所接受。
2.病原體檢測(cè)：采用熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)可以對(duì)淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、結(jié)核分枝桿菌、EB病毒和巨細(xì)胞病毒等病原體進(jìn)行定量測(cè)定。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。
3.藥物療效考核：對(duì)乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)定量分析顯示：病毒量與某些藥物的療效關(guān)系。HCV高水平表達(dá)，干擾素治療作用不敏感，而HCV低滴度，干擾素作用敏感；在拉米夫定治療過程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，隨后若再度上升或超出以前水平，則提示病毒發(fā)生變異。
4.腫瘤基因檢測(cè)：盡管腫瘤發(fā)病的機(jī)理尚未清楚，但相關(guān)基因發(fā)生突變是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因已被廣泛接受。癌基因的表達(dá)增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出現(xiàn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR不但能有效地檢測(cè)到基因的突變，而且可以準(zhǔn)確檢測(cè)癌基因的表達(dá)量。目前用此方法進(jìn)行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細(xì)胞性白血病WT1基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關(guān)的病毒基因等多種基因的表達(dá)檢測(cè)。
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