破傷風(fēng)梭菌培養(yǎng)基基礎(chǔ)的背景與應(yīng)用！

一、背景

破傷風(fēng)梭菌培養(yǎng)基基礎(chǔ)是破傷風(fēng)梭菌生長(zhǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，主要用于破傷風(fēng)梭菌培養(yǎng)及傷風(fēng)梭菌產(chǎn)毒。破傷風(fēng)梭菌毒素是破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)生的一種神經(jīng)蛋白質(zhì)毒素，通過抑制抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，引起超反射反應(yīng)和橫紋肌痙攣。

典型癥狀是在肌緊張性收縮(肌強(qiáng)直、發(fā)硬)的基礎(chǔ)上，陣發(fā)性強(qiáng)烈痙攣，通常受影響的肌群是咀嚼肌，隨后順序?yàn)槊娌勘砬榧?、頸、背、腹、四肢肌，最后為膈肌。

相應(yīng)出現(xiàn)的征象為：張口困難(牙關(guān)緊閉)、蹙眉、口角下縮、咧嘴“苦笑”、頸部強(qiáng)直、頭后仰；當(dāng)背、腹肌同時(shí)收縮，因背部肌群較為有力．軀干因而扭曲成弓、結(jié)合頸、四肢的屈膝、彎肘、半握拳等痙攣?zhàn)藨B(tài)，形成“角弓反張”或“側(cè)弓反張”；膈肌受影響后，發(fā)作時(shí)面唇青紫，通氣困難，可出現(xiàn)呼吸暫停。破傷風(fēng)桿菌是引導(dǎo)起破傷風(fēng)的病原菌，大量存在于人和動(dòng)物腸道中，由糞便污染土壤，經(jīng)傷口感染引起疾病。

該菌株在普通瓊脂平板上培養(yǎng)24～48小時(shí)后，可形成直徑1mm以上不規(guī)則的菌落，中心緊密，周邊疏松，似羽毛狀菌落，易在培養(yǎng)基表面遷徙擴(kuò)散。在血液瓊脂平板上有明顯溶血環(huán)，在皰肉培養(yǎng)基中培養(yǎng)，肉湯渾濁，肉渣部分被消化，微變黑，產(chǎn)生氣體，生成甲基硫醇(有臭味)及硫化氫。一般不發(fā)酵糖類，能液化明膠，產(chǎn)生硫化氫，形成吲哚，不能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽。該菌株在生物技術(shù)領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用，然而在常用的培養(yǎng)基中破傷風(fēng)梭菌增殖速度較慢，同時(shí)易發(fā)生染菌現(xiàn)象。

二、應(yīng)用

用于提高破傷風(fēng)類毒素免疫原性的初步研究：

破傷風(fēng)梭菌產(chǎn)生的破傷風(fēng)毒素，經(jīng)0.4%甲醛滅活后,失去毒性而仍保留抗原性稱之為破傷風(fēng)類毒素。類毒素精制后,可作為疫苗對(duì)人和動(dòng)物進(jìn)行免疫接種。但機(jī)體感染后不能獲得終身免疫力，且此免疫程序較長(zhǎng)。為了減輕接種的副反應(yīng)，提高免疫效果，減少注射次數(shù)，提高接種覆蓋率，采用原核細(xì)胞表達(dá)具有高免疫原性的重組C蛋白，用于生產(chǎn)疫苗及免疫接種，以避免出現(xiàn)副作用；另外，用雙功能交聯(lián)劑戊二醛聚合破傷風(fēng)毒素，使毒素分子之間進(jìn)行交聯(lián)，從而產(chǎn)生分子量較大的，表面決定簇多的聚合類毒素。

該類毒素作為免疫的抗原，可以誘發(fā)較高的抗體水平，加強(qiáng)免疫記憶，延長(zhǎng)保護(hù)機(jī)體免受破傷風(fēng)的侵害的時(shí)間。

1、利用PCR技術(shù)從破傷風(fēng)梭菌基因組DNA中擴(kuò)增出1356 bp的破傷風(fēng)毒素C基因，將該基因片段插入到表達(dá)載體pET32a(+)中，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)中,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，觀察各種條件下對(duì)重組菌蛋白表達(dá)的影響。

對(duì)重組后蛋白用Ni-NAT親和層析的技術(shù)純化C融合蛋白，然后進(jìn)行小鼠免疫實(shí)驗(yàn)并測(cè)定效價(jià)。研究顯示：經(jīng)SDS-PAGE分析,重組破傷風(fēng)毒素C蛋白(rTTC)的表達(dá)量占可溶性蛋白的28.19%,純化后得到蛋白純度為96.92%。免疫印跡證實(shí)該重組蛋白是破傷風(fēng)毒素C蛋白抗原，對(duì)小鼠免疫,三免后14 d rTTC組小鼠抗體效價(jià)仍能達(dá)到1∶16 000。所獲得的重組蛋白具有良好的免疫原性。

2、經(jīng)過厭氧培養(yǎng)的破傷風(fēng)梭菌，產(chǎn)毒后進(jìn)行脫毒、精制，在產(chǎn)毒期間進(jìn)行毒力鑒定、解毒和毒性逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)。再由戊二醛聚合破傷風(fēng)類毒素，經(jīng)不同的聚合條件的優(yōu)化，進(jìn)行分子量和Lf的測(cè)定，然后免疫小鼠和兔子，并測(cè)定其免疫效價(jià)。培養(yǎng)的毒素可以作為制備類毒素使用，脫毒精制后的類毒素,經(jīng)毒力鑒定試驗(yàn)、解毒試驗(yàn)和毒性逆轉(zhuǎn)試驗(yàn)檢測(cè)后均合格。

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