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          細(xì)胞培養(yǎng)技巧方法

          來源:深圳艾維迪泰生物科技有限公司   2022年02月18日 10:33  
            細(xì)胞復(fù)蘇
           
            細(xì)胞復(fù)蘇和凍存講究“慢凍快溶”,復(fù)蘇時(shí)一定要將凍存在液氮或-80℃中凝固的細(xì)胞凍存液快速融化至37℃,使胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化,避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶,對(duì)細(xì)胞造成損害。
           
            復(fù)蘇準(zhǔn)備
           
            ●打開水浴鍋加熱至37℃。
           
            ● 超凈臺(tái)上放好離心管(一般15ml的),細(xì)胞培養(yǎng)瓶,移液管,紫外滅菌至少20至30分鐘,吹風(fēng)5至10分鐘除去臭氧。
           
            ● 37℃預(yù)熱好要復(fù)蘇細(xì)胞的培養(yǎng)液,也可以不用預(yù)熱培養(yǎng)液,根據(jù)細(xì)胞情況選擇。
           
            ●向離心管中加約5至10ml培養(yǎng)液,從液氮罐或-80℃中取出凍存細(xì)胞,立即將凍存管放入37℃水浴中并輕輕搖動(dòng),待融化后(約2min即可)立即將解凍的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含培養(yǎng)液的離心管中,800-1000rpm下離心5min,棄上清,加適量*培養(yǎng)液輕輕吹打重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,輕晃使瓶底液體分散均勻,標(biāo)好細(xì)胞名稱、代數(shù)、復(fù)蘇日期,顯微鏡下觀察后放入37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中。一般貼壁細(xì)胞過夜即可貼壁,換液和傳代時(shí)間根據(jù)不同細(xì)胞生長情況而定。
           
            細(xì)胞復(fù)蘇注意事項(xiàng)
           
            ?復(fù)蘇時(shí)動(dòng)作要快,盡量減少胞內(nèi)形成冰晶,影響復(fù)蘇后細(xì)胞活率。
           
            ? 融化時(shí)盡量不要碰到管口,以免容易造成污染。
           
            ?若一次性需要復(fù)蘇細(xì)胞很多,可以分批水浴解凍,防止傳熱不佳使得細(xì)胞融化時(shí)間延長。
           
            ?若需要同時(shí)復(fù)蘇好幾種細(xì)胞,提前在離心管和培養(yǎng)瓶上做好標(biāo)記,或記住自己擺放的位置,不要弄混亂。
           
            細(xì)胞傳代培養(yǎng)
           
            1. 懸浮細(xì)胞傳代
           
            待培養(yǎng)液中酚紅指示劑變黃,在已紫外滅菌后的超凈臺(tái)上吸出或倒出細(xì)胞懸液至離心管中(根據(jù)細(xì)胞液的量選擇15ml或50ml離心管),800-1000rpm下離心5min,棄去營養(yǎng)匱乏的舊培養(yǎng)液,加預(yù)熱好的*培養(yǎng)液適量,輕輕吹打重懸細(xì)胞后,吸取適量細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,或直接取適量細(xì)胞懸液至新培養(yǎng)瓶中,再補(bǔ)加一定量新鮮*培養(yǎng)液進(jìn)行傳代,有些脆弱的細(xì)胞用自然沉降法沉降細(xì)胞,吸去上面舊培養(yǎng)液加入新的*培養(yǎng)液后吹散進(jìn)行傳代。傳代接種的細(xì)胞密度根據(jù)不同細(xì)胞生長情況而定,一般間隔1-2天即可傳代一次。
           
            2. 貼壁細(xì)胞傳代
           
            待培養(yǎng)瓶底中細(xì)胞覆蓋率達(dá)70%-80%時(shí),在經(jīng)紫外滅菌后的超凈臺(tái)上,棄去舊細(xì)胞培養(yǎng)液,用無菌1*PBS洗滌瓶底細(xì)胞1-2次,用1ml(T25培養(yǎng)瓶)或2ml(T75培養(yǎng)瓶)trypsin溶液37℃下作用細(xì)胞,待顯微鏡下細(xì)胞回縮變圓,少部分細(xì)胞出現(xiàn)流沙狀時(shí),快速吸去trypsin溶液,加預(yù)熱好的新鮮*培養(yǎng)液終止消化,輕輕吹打使細(xì)胞脫落且分散均勻,直接吸取適量細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶中,或800-1000rpm下離心去上清,加適量新鮮*培養(yǎng)液吹打重懸細(xì)胞,然后轉(zhuǎn)移適量細(xì)胞懸液至新培養(yǎng)瓶中,再加入一定量*培養(yǎng)液,搖勻瓶底細(xì)胞液后進(jìn)行培養(yǎng)。
           
            細(xì)胞傳代培養(yǎng)注意事項(xiàng)
           
            ? 吹打時(shí)每次不要排完移液管中液體,同時(shí)控制吹打節(jié)奏,這樣不容易吹出泡沫,泡沫對(duì)細(xì)胞有損傷作用,而且很難再顯微鏡下觀察清楚有沒有*吧細(xì)胞吹打下來。
           
            ?不要等到貼壁細(xì)胞*鋪滿瓶底,要留有一定空隙時(shí)細(xì)胞狀態(tài)才良好。
           
            ?消化時(shí)最好不要等到細(xì)胞成片飄起,否則細(xì)胞狀態(tài)受影響且第二天培養(yǎng)中死細(xì)胞較多。
           
            細(xì)胞凍存
           
            凍存的細(xì)胞要處在指數(shù)生長期。懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞經(jīng)離心后用凍存液重懸,計(jì)數(shù),凍存的細(xì)胞密度一般3*106-1*107 cells/ml,最好不少于1*106 cells/ml,否則復(fù)蘇后難以養(yǎng)起來,將重懸計(jì)數(shù)后的細(xì)胞懸液以1-1.5ml快速分裝至各凍存管中,迅速擰緊蓋子,放入梯度凍存盒然后置于-80℃過夜,也可以先4℃放置30分鐘,再-20℃放置1-2小時(shí),最后-80℃過夜(16-18小時(shí)),若梯度凍存盒不夠或無凍存盒,可以將凍存管置于泡沫盒中,用棉花包起來,棉花厚度約1cm,置于-80℃過夜,第二天取出-80℃細(xì)胞存放至液氮罐中,并在記錄好存放位置信息。
           
            凍存準(zhǔn)備
           
            ●配制好凍存液。一般凍存液為培養(yǎng)液,血清,DMSO按照7:2:1的比例配制,也可以血清和DMSO按照9:1配制,不管哪種凍存液配制,血清多多益善,但DMSO都不可以多,以免對(duì)細(xì)胞造成損傷。
           
            ●準(zhǔn)備好凍存管,標(biāo)上細(xì)胞名稱,代次,凍存批號(hào),凍存日期。
           
            ●準(zhǔn)備好細(xì)胞程序降溫盒或凍存用的材料,程序降溫盒放置室溫后使用。
           
            細(xì)胞凍存注意事項(xiàng)
           
            ?程序降溫盒有無需有毒異丙醇填充的,有利于實(shí)驗(yàn)人員身體健康。
           
            ?DMSO有毒且皮膚會(huì)吸收,做好防護(hù)措施。DMSO本身不長菌,不需要做滅菌處理。
           
            ?由-80℃轉(zhuǎn)至液氮時(shí)迅速,避免溫度上升影響細(xì)胞活性。
           
            ?每個(gè)凍存管不要加入體積太多,以免凍存時(shí)凝固體積膨脹,撐開凍存管,且在下次復(fù)蘇時(shí),融化較慢,導(dǎo)致復(fù)蘇后細(xì)胞存活率不高。

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