外泌體內(nèi)容物包含蛋白質(zhì)、RNA、DNA和脂類，可被用于藥物傳遞系統(tǒng)與疾病的新型診斷標(biāo)志物，具有重要的研究意義。但傳統(tǒng)的技術(shù)方法如Western Blot，ELISA，無法獲得單個外泌體的蛋白表型，更不能將檢測內(nèi)容物與粒徑分析、濃度分析、計數(shù)等聯(lián)系起來，大地制約了外泌體內(nèi)容物的相關(guān)研究。單外泌體表征分析（Exoview）用免疫識別將定的外泌體進行捕獲分離，然后再對目標(biāo)外泌體的表面標(biāo)志物及內(nèi)容物（如攜帶的蛋白質(zhì)、RNA、DNA及細胞因子）進行定量分析，從而更加全面地反映外泌體內(nèi)容物的性。近日，《Life》期刊刊登了Kammala等人的新研究成果，該團隊使用全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng) Exoview檢測胎膜和胎盤外泌體的內(nèi)容物，來研究母胎界面的藥物轉(zhuǎn)運。

Exoview檢測流程：

早產(chǎn)是種發(fā)生率*的產(chǎn)科疾病，據(jù)估計，每年有1500萬名嬰兒出生過早，即每10名嬰兒中就超過人。早產(chǎn)兒的死亡率很高，每年大約有100萬名嬰兒死于早產(chǎn)并發(fā)癥，許多存活下來的兒童也要面臨終生殘疾，包括學(xué)習(xí)障礙和視力、聽力問題。直至今日，由于研究結(jié)果的不同，自發(fā)性早產(chǎn)的治療方法也各不相同。由于孕期的*生理環(huán)境會導(dǎo)致藥代動力學(xué)的改變以及孕期藥物治療的倫理限制，進而導(dǎo)致治療過程無法標(biāo)準化。

近期，研究人員發(fā)現(xiàn)胎膜（FM）和胎盤（PLA）能夠表達多種藥物轉(zhuǎn)運蛋白。由于胎膜具有保護作用，也有可能能夠控制轉(zhuǎn)運蛋白進行藥物的轉(zhuǎn)運。Kammala等^[1]研究了種與藥物轉(zhuǎn)運相關(guān)的乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)在胎膜上的表達，以及在不同的胎膜細胞分泌的外泌體中是否含有BCRP，從而促進母胎界面的藥物轉(zhuǎn)運。

圖1 (A) BCRP在胎膜和胎盤的表達；(B) BCRP在胎膜和胎盤的IHC圖像；(C) 胎膜和胎盤的BCRP蛋白表達水平。

圖2 (A) 使用流式細胞儀測定在不同細胞BCRP的表達水平；(B) 不同細胞的熒光強度對比；(C) 不同細胞的BCRP蛋白水平。

圖3 eFFlux熒光外流法檢測BCRP功能性，BCRP被抑制后會導(dǎo)致熒光染料被排出細胞。(A) 不同細胞經(jīng)BCRP抑制后的熒光計數(shù)對比；(B) 以熒光強度表示不同細胞的藥物耐受性。

由圖1-圖3中的各項檢測結(jié)果可知，BCRP可在胎膜的多種細胞中表達，以胎盤絨毛膜癌細胞(BeWo)作為對照，其中絨毛膜滋養(yǎng)層細胞(CTC)的BCRP表達要高于BeWo；不同胎膜細胞均可在不同程度上控制藥物轉(zhuǎn)運。基于以上結(jié)果，研究組選擇提取CTC和BeWo分泌的外泌體，并使用Exoview進行了外泌體表型分析。

圖4 (A)CTC與BeWo兩種細胞來源外泌體表面BCRP+的占比；(B) 兩種外泌體內(nèi)容物BCRP+的占比；(C) CTC來源外泌體內(nèi)容物BCRP熒光染色圖像；(D) BeWo來源外泌體內(nèi)容物BCRP熒光染色圖像。

由計數(shù)結(jié)果可知，無論是來源于哪種細胞，亦或是位于外泌體表面還是內(nèi)部，BCRP與CD63的共表達均高于CD81和CD9；兩種來源的外泌體中，BCRP更多作為內(nèi)容物由外泌體進行轉(zhuǎn)運，BeWo來源外泌體中含BCRP內(nèi)容物的外泌體占比約為CTC來源外泌體的兩倍（圖A&B）。

研究組·次發(fā)現(xiàn)了CTC和BeWo細胞以外泌體內(nèi)容物的形式轉(zhuǎn)運BCRP。前的研究發(fā)現(xiàn)，含CD63的外泌體可將跨膜蛋白轉(zhuǎn)運至管腔內(nèi)囊泡中，而藥物轉(zhuǎn)運蛋白也是種跨膜蛋白，可以被轉(zhuǎn)運至定的組織發(fā)揮作用。胎膜細胞可通過含有BCRP的外泌體，以旁分泌的形式使其他細胞獲得藥物轉(zhuǎn)運蛋白，影響定組織的環(huán)境。通過這項新發(fā)現(xiàn)，改變現(xiàn)有的產(chǎn)科藥理學(xué)，可以開發(fā)以BCRP+外泌體，尤其是CD63+/BCRP+的外泌體作為靶標(biāo)的新型靶向藥物，有效提高藥物轉(zhuǎn)運能力，降低早產(chǎn)的發(fā)生率，減輕孕期用藥的不良反應(yīng)，改善現(xiàn)有的孕期治療方法。

參考文獻：

[1] Kammala,   A., Benson, M., Ganguly, E., Radnaa, E., Kechichian, T., Richardson, L.,   & Menon, R. (2022). Fetal Membranes Contribute to Drug Transport across   the Feto-Maternal Interface Utilizing the Breast Cancer Resistance Protein   (BCRP). Life, 12(2), 166.

全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)（ExoView R100）簡介

作為外泌體表征分析的倡·導(dǎo)者，美國NanoView Biosciences于2018年推出了全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)ExoView，該系統(tǒng)經(jīng)推出，便引起了外泌體域科研工作者的廣泛關(guān)注，憑借其穩(wěn)定、出色的性能，短短幾年在全球已有近百個客戶，發(fā)表文獻100多篇。ExoView的精準表征，能夠幫助科學(xué)家更深入地了解外泌體與疾病之間的關(guān)系，助力疾病診斷和新藥開發(fā)。

Nanoview所開發(fā)的全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)（ExoView R200）采用單粒子干涉反射成像傳感器（SP-IRIS）技術(shù)，是款無需純化的全自動的新型外泌體表征設(shè)備。該設(shè)備能夠提供全·方位的外泌體表征信息，包括顆粒大小、計數(shù)、表型與生物標(biāo)志物共定位等，提供多層次和全面的外泌體測量解決方案。

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