導(dǎo)讀

細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)嚴(yán)重威脅到全球人類和動(dòng)物的健康，研究細(xì)菌耐藥性是微生物研究的重點(diǎn)領(lǐng)域。近年來，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF）已成為微生物鑒定的常規(guī)技術(shù)，但其在微生物耐藥性研究中的應(yīng)用尚處于起步階段。替加環(huán)素是一種新型四環(huán)素類抗生素，被世界衛(wèi)生組織列為治療臨床多重耐藥菌感染極其重要的抗菌藥物，被認(rèn)為是治療產(chǎn)碳青霉烯酶多重耐藥腸桿菌感染的“最后一道防線”。然而，質(zhì)粒介導(dǎo)的新型高水平替加環(huán)素耐藥基因Tet(X3/X4)的出現(xiàn)，威脅到替加環(huán)素在臨床多重耐藥菌感染中的療效，但其潛在機(jī)制尚不清楚。使用MALDI-TOF快速地對替加環(huán)素耐藥基因Tet(X)不同突變體的單加氧產(chǎn)物進(jìn)行定性分析的方法，大大地拓展了MALDI-TOF在細(xì)菌耐藥性檢測中的應(yīng)用。

細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)威脅抗生素的療效

近期，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院孫堅(jiān)教授團(tuán)隊(duì)在微生物領(lǐng)域知名刊物《mSystems》上發(fā)表題為《Evolutionary Trajectory of the Tet(X) Family: Critical Residue Changes towards High-Level Tigecycline Resistance》的研究成果。該研究探索了導(dǎo)致Tet(X)功能增強(qiáng)的關(guān)鍵氨基酸變化，并據(jù)此闡明了Tet(X)的結(jié)構(gòu)特征和進(jìn)化路徑。通過結(jié)構(gòu)域互換和位點(diǎn)定向突變實(shí)驗(yàn)，成功識別了5個(gè)導(dǎo)致Tet(X)活性增強(qiáng)的殘基突變(L282S、A339T、D340N、V350I和K351E)。結(jié)構(gòu)分析表明突變殘基不直接參與底物結(jié)合或催化，而是通過間接改變構(gòu)象動(dòng)力學(xué)影響酶的活性。該研究擴(kuò)展了對Tet(X)同系物的結(jié)構(gòu)特征和功能演變的認(rèn)識，為后續(xù)特異性抑制劑的篩選和新型四環(huán)素類抗生素的開發(fā)提供了依據(jù)。

mSystems，May/June 2021 Volume 6 Issue 3 e00050-21

MALDI-TOF/TOF對不同Tet(X)突變體進(jìn)行功能驗(yàn)證

在BL21(DE3)-pET28大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)中引入Tet(X2)、Tet(X4)和3個(gè)定點(diǎn)誘變突變體（L282S、A339T-D340N和V350l-K351E）。將體外純化后的蛋白（酶）依次加入含Mg2+和NADPH的伊拉瓦環(huán)素緩沖液中，反應(yīng)15分鐘后，用質(zhì)譜法檢測藥物的單加氧產(chǎn)物峰（圖1）。取1 μL的上清溶液點(diǎn)到靶板上，待干燥后，覆蓋1 μL CHCA（ α-氰基-4-羥基肉桂酸）基質(zhì)溶液，待自然干燥后，將靶板送入質(zhì)譜分析（島津AXIMA-Performance）。

圖1. AXIMA Performance – MALDI TOF/TOF上機(jī)流程圖

結(jié)果顯示，在反應(yīng)15分鐘后，所有突變體在m/z 574處都出現(xiàn)了額外的峰，與伊拉瓦環(huán)素分子量增加16Da后的單加氧產(chǎn)物的分子量相對應(yīng)（圖2)。結(jié)合紫外全波長掃描結(jié)果，證明了這幾個(gè)位點(diǎn)的氨基酸變化僅增加酶的活性而未改變Tet(X)的單加氧特性。

圖2. 不同Tet(X)突變體的功能驗(yàn)證

(a) Tet(X)降解伊拉瓦環(huán)素的模型圖 (b)基于MALDI-TOF的單加氧產(chǎn)物的質(zhì)譜測定

AXIMA Performance – MALDI-TOF/TOF 質(zhì)譜儀

AXIMA Performance 作為島津功能強(qiáng)大的科學(xué)研究級MALDI-TOF/TOF儀器，可用于常規(guī)分子量檢測、微生物的快速鑒定、聚合物分析。還可以多方位的開展高通量蛋白質(zhì)組學(xué)研究，包括多肽、蛋白分子量測定，蛋白鑒定，多肽序列分析，翻譯后修飾研究，如磷酸化，糖基化研究等。高通量自動(dòng)化蛋白鑒定，高分辨雙離子門，高能CID技術(shù)進(jìn)行MS/MS，新型曲線場反射器等前沿技術(shù)使該儀器成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的有力工具。

圖3. 島津AXIMA-Performance質(zhì)譜儀

l 真正的高能MS/MS—實(shí)驗(yàn)室參考系的碰撞能量為20keV的CID。

l 采用革新的離子門技術(shù)達(dá)到理想的母離子選擇分辨率。

l 出色的靈敏度-無損失技術(shù)保證無MS/MS信號丟失。

專家心聲

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院孫堅(jiān)教授在開展細(xì)菌耐藥性相關(guān)的課題研究中，常使用島津MALDI-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行樣品檢測。孫老師表示，在細(xì)菌耐藥性研究過程中，島津公司生產(chǎn)的AXIMA Performance質(zhì)譜儀能夠幫助他們快速地對不同Tet(X)突變體的單加氧產(chǎn)物進(jìn)行定性分析，該儀器具備操作簡單，高通量和準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，為該團(tuán)隊(duì)的研究提供了有力的幫助，提高了研究效率。

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院孫堅(jiān)教授

參考文獻(xiàn)

1.Cui C-Y, He Q, Jia Q-L, et al. 2021. Evolutionary trajectory of the Tet(X) family: critical residue changes towards high-level tigecycline resistance. mSystems 6:e00050-21. https://doi.org/10.1128/mSystems.00050-21.

2.Cui Z-H, Zheng Z-J, Tang T, et al. (2020) Rapid Detection of High-Level Tigecycline Resistance in Tet(X)-Producing Escherichia coli and Acinetobacter spp. Based on MALDI-TOF MS. Front. Cell. Infect. Microbiol. 10:583341. doi: 10.3389/fcimb.2020.583341.

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