簡(jiǎn)介

成型的腫瘤是一個(gè)復(fù)雜的組織，它不僅由腫瘤細(xì)胞組成，還包括也基質(zhì)細(xì)胞，炎癥細(xì)胞，脈管系統(tǒng)和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），所有這些總和定義為腫瘤微環(huán)境（TME），并且在腫瘤惡性進(jìn)展、免疫逃逸和治療抵抗中發(fā)揮重要作用^[1]。針對(duì)腫瘤微環(huán)境的特點(diǎn)開發(fā)安全有效的腫瘤免疫療法是當(dāng)前腫瘤治療領(lǐng)域中*前景的熱點(diǎn)之一^[2]。至今， 已有多項(xiàng)批準(zhǔn)藥物用于不同類型腫瘤的治療，在腫瘤治療方面取得了令人矚目的成就^{[2, 3]}。然而，腫瘤細(xì)胞也能夠通過多種途徑負(fù)向調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答，從而逃逸機(jī)體的免疫監(jiān)管。因此，免疫治療仍存在巨大的挑戰(zhàn)，比如治療效果和患者反應(yīng)的不可預(yù)估性，腫瘤免疫治療抵抗性，以及有效生物標(biāo)志物缺乏等等^[4]

免疫治療的陽性反應(yīng)通常依賴于腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境（TME）內(nèi)免疫調(diào)節(jié)的相互作用。在這些相互作用下，腫瘤微環(huán)境在抑制或增強(qiáng)免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用。認(rèn)識(shí)免疫治療與TME間的相互作用不僅是剖析作用機(jī)制的關(guān)鍵，為改善目前免疫治療的療效提供新的方法也具有十分重要的意義^[5]。

多重免疫組化技術(shù)在評(píng)估腫瘤微環(huán)境中各細(xì)胞組分的表達(dá)豐度，相互作用以及空間表型信息有*的優(yōu)勢(shì)?？稍谕粡埱衅贤瑫r(shí)對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記，幫助研究者定量評(píng)估細(xì)胞的表型和活性，全景刻畫腫瘤免疫微環(huán)境以及細(xì)胞間的原位空間信息，能讓我們更深入地了解腫瘤的發(fā)生機(jī)制，更有可能預(yù)測(cè)腫瘤對(duì)治療的反應(yīng)^[6-9]。本方案中， 我們使用了TissueGnostics公司TissueFAXS Cytometry全景組織流式定量分析技術(shù)結(jié)合Absin七色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒(abs50015)，在扁桃體腫瘤樣本中開展的多色免疫組化應(yīng)用探索。 

Panel及染料信息

*Panel及染料信息（對(duì)樣本中腫瘤細(xì)胞及不同免疫細(xì)胞表型進(jìn)行多色標(biāo)記）

在石蠟包埋的甲狀腺癌組織切片上對(duì)切片進(jìn)行TSA酪胺 信號(hào)方法技術(shù)，采用HRP標(biāo)記的二抗，HRP催化加入體 系的熒光素底物，生成活化熒光底物，活化底物可與抗原上的Tyrosine共價(jià)結(jié)合，使樣品上穩(wěn)定地共價(jià)結(jié)合熒光素。之后用熱修復(fù)洗去非共價(jià)結(jié)合的抗體，避免交叉反應(yīng)，如此往復(fù)實(shí)現(xiàn)多重?zé)晒鈽?biāo)記。

使用Absin七色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒的全新一代T S A 染色技術(shù)同時(shí)標(biāo)記 6 種生物標(biāo)志物后， 使用TissueFAXS Spectra系統(tǒng)進(jìn)行連續(xù)全光譜高倍率成像， 構(gòu)建全景（多光譜）虛擬切片。獲得清晰的多色樣本圖像及各單通道獨(dú)立信號(hào)，從多靶點(diǎn)角度描繪復(fù)雜的腫瘤免疫微環(huán)境。

多色免疫熒光圖像獲取及光譜拆分

圖 1. 人甲狀腺癌組織的多重IHC 染色光譜拆分。去除背景自發(fā)熒光或血細(xì)胞/膠原等自發(fā)熒光以及去除粘液團(tuán)非特異性染色的各抗體獨(dú)立真實(shí)染色圖像。使用人甲狀腺癌FFPE的七色多光譜圖像及光譜拆分結(jié)果。

組織原位蛋白細(xì)胞亞群分析

TG的細(xì)胞核識(shí)別算法在組織原位提供精準(zhǔn)的單細(xì)胞識(shí)別基礎(chǔ)，大數(shù)據(jù)的可視化正反向回溯校驗(yàn)技術(shù)為其精準(zhǔn)性提供了進(jìn)一步的保障。TG組織原位流式分析功能對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行層層篩選，可獲得雙標(biāo)、三標(biāo)乃至更 多標(biāo)的細(xì)胞的定量表達(dá)及空間定位信息，可個(gè)性化分析組織切片中任意細(xì)胞的表型特征，為細(xì)胞亞群原位可視化精準(zhǔn)分型提供強(qiáng)大的支撐。
圖2.利用Absin七色多重?zé)晒饷庖呓M化技術(shù)多色標(biāo)記及TissueFAXS Cytometry 技術(shù)對(duì)樣本進(jìn)行免疫細(xì)胞分型篩選及單靶點(diǎn)定量。圖中展示的是通過的組織流式散點(diǎn)圖對(duì)CD20+CD4-CD3-細(xì)胞的層層篩選識(shí)別（左圖綠色圈出），散點(diǎn)圖可追溯到圖像 的每一個(gè)單細(xì)胞。首先是CD20+陽性細(xì)胞群（右上圖）對(duì)此細(xì)胞群設(shè)立Cutoff線，篩選陽性細(xì)胞。并引用該陽性細(xì)胞群到下一散點(diǎn)圖，篩選CD4與CD3陰性細(xì)胞群（右下圖）。

圖 3.可視化正反向回溯校驗(yàn)示意圖。點(diǎn)擊圖像中識(shí)別到的每一個(gè)指標(biāo)都可在右側(cè)散點(diǎn)圖中一一對(duì)應(yīng)，同時(shí)散點(diǎn)圖中的每個(gè)點(diǎn)都可精準(zhǔn)追溯到圖像中，便于我們觀察。

空間多維度定量解析腫瘤微環(huán)境

利用TissueFAXS Cytometry技術(shù)實(shí)現(xiàn)從單細(xì)胞、細(xì)胞群、組織結(jié)構(gòu)乃至器官級(jí)別的多模態(tài)，跨尺度的空間關(guān)系量化分析研究。比如可在研究腫瘤微環(huán)境方向通過空間數(shù)據(jù)挖掘延伸至腫瘤亞微環(huán)境，進(jìn)一步細(xì)化對(duì)腫瘤亞微環(huán)境中多種標(biāo)記細(xì)胞與單細(xì)胞或細(xì)胞群體之間、單細(xì)胞與腫瘤組織之間、特定細(xì)胞群體與腫瘤組織之間，腫瘤組織與血管之間等復(fù)雜的相互作用關(guān)系、進(jìn)而衍生出更為豐富社會(huì)學(xué)關(guān)系，挖掘以細(xì)胞社區(qū)為功能單位的科學(xué)信息，為解釋疾病的發(fā)生發(fā)展提供重要的數(shù)據(jù)來源。

圖4.以腫瘤為中心細(xì)胞群體空間分布圖。利用TissueFAXS Cytometry 技術(shù)中人工智能Classifier功能對(duì)組織樣本腫瘤與間質(zhì)區(qū)域進(jìn)行特異性識(shí)別，并以腫瘤區(qū)域?yàn)橹行?，微米?jí)別精度對(duì)微環(huán)境中免疫細(xì)胞的空間分布進(jìn)行單細(xì)胞量化分析，不同顏色代表距離腫瘤的不同距離范圍。右側(cè)散點(diǎn)圖中不同顏色點(diǎn)數(shù)表示距離腫瘤不同距離的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量。

圖5.腫瘤細(xì)胞（綠色）與NK細(xì)胞（黃色）的相互作用細(xì)胞社會(huì)關(guān)系分析示意圖。通過TissueFAXS Cytometry 技術(shù)分析腫瘤細(xì)胞與NK細(xì)胞的距離關(guān)系，統(tǒng)計(jì)腫瘤細(xì)胞周圍30范圍內(nèi)的NK細(xì)胞，并以連線示意。

TissueFAXS Cytometry全景組織流式定量分析平臺(tái)

基于組織原位的精準(zhǔn)單細(xì)胞定量，強(qiáng)大的人工智能（AI）的特征性組織識(shí)別以及像素級(jí)的精細(xì)空間量化分析等強(qiáng)大的運(yùn)算處理功能自由交互聯(lián)用，提供從染色到成像到數(shù)據(jù)挖掘的一站式解決方案，并可在腫瘤免疫學(xué)，神經(jīng)生物學(xué)等不同的復(fù)雜微環(huán)境中實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的定制化分析。

圖 6.TissueFAXS Cytometry 工作流程示意圖。

References:

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2.Bejarano, L., M.J.C. Jordao, and J.A. Joyce, Therapeutic Targeting of the Tumor Microenvironment. Cancer Discov, 2021. 11(4): p. 933-959.
3.Galon, J. and D. Bruni, Approaches to treat immune hot, altered and cold tumours with combination immunotherapies. Nat Rev Drug Discov, 2019. 18(3): p. 197-218.
4. Hegde, P.S. and D.S. Chen, Top 10 Challenges in Cancer Immunotherapy. Immunity, 2020. 52(1): p. 17-35.
5.Tang, H., J. Qiao, and Y.X. Fu, Immunotherapy and tumor microenvironment. Cancer Lett, 2016. 370(1): p. 85-90.
6.Tsujikawa, T., et al., Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Rep, 2017. 19(1): p. 203-217.
7.Chen, S., et al., Multiomic Analysis Reveals Comprehensive Tumor Heterogeneity and Distinct Immune Subtypes in Multifocal Intrahepatic Cholangiocarcinoma. Clin Cancer Res, 2022. 28(9): p. 1896-1910.
8.Chen, X., et al., CD8(+) T effector and immune checkpoint signatures predict prognosis and responsiveness to immunotherapy in bladder cancer. Oncogene, 2021. 40(43): p. 6223-6234.
9.Wang, T., et al., Spatial distribution and functional analysis define the action pathway of Tim-3/Tim-3 ligands in tumor development. Mol Ther, 2022. 30(3): p. 1135-1148.

愛必信（absin）提供優(yōu)質(zhì)多重應(yīng)該免疫組化試劑盒

Absin多重?zé)晒饷庖呓M化試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)單片多標(biāo)，無論是看腫瘤微環(huán)境還是看免疫浸潤(rùn)，無論是進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)還是共定位分析，我們都可以實(shí)現(xiàn)，目前最高可做到六指標(biāo)七色哦~