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我們經(jīng)常遇到過(guò)這個(gè)問題：自己養(yǎng)的細(xì)胞開始長(zhǎng)的還挺好的，可是凍存之后復(fù)蘇會(huì)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)不好甚至復(fù)蘇不起來(lái)。出現(xiàn)這種問題很有可能就是你的凍存環(huán)節(jié)出了問題。
當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下時(shí)，細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，冰晶的大小對(duì)細(xì)胞有影響是不同的，大冰晶容易造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂，因此就會(huì)造成我們復(fù)蘇出來(lái)的細(xì)胞存活率、狀態(tài)等與凍存前的狀態(tài)相差甚遠(yuǎn)。那么我們要怎么解決這些問題呢？
首先我們?cè)趦龃娴倪^(guò)程中要減少冰晶的形成，尤其是大冰晶的形成：緩慢凍存細(xì)胞，可使細(xì)胞內(nèi)避免產(chǎn)生大的冰晶。
那么我們?cè)撛鯓觾龃婕?xì)胞呢？
一、慢凍細(xì)胞
1、常規(guī)程序：
使用程序降溫盒
當(dāng)溫度在-25℃以上時(shí)，1-2℃/min。
當(dāng)溫度在-25℃以下時(shí)，5-10℃/min。
當(dāng)溫度達(dá)到-100℃時(shí)，可迅速轉(zhuǎn)入液氮中。
2、簡(jiǎn)易程序：
冷凍管管口朝上，放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過(guò)線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘下降1-2℃的速度，在40min內(nèi)降至液氮表面過(guò)夜，次晨投入液氮中。
3、傳統(tǒng)程序：
冷凍管置于4℃10min，-20℃30min，-80℃16-18h（或隔夜），液氮長(zhǎng)期儲(chǔ)存。
二、低溫保護(hù)劑
常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過(guò)程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。
三、細(xì)胞凍存方法
1、預(yù)先配制凍存液：
凍存液比例多種，根據(jù)細(xì)胞的特性進(jìn)行調(diào)整凍存液的比例：
5%—10%DMSO+20%—90%血清+0%—70%基礎(chǔ)培養(yǎng)液；
2、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，去除舊培養(yǎng)液，用PBS清洗1-2次；去掉培養(yǎng)瓶里的殘余血清；
3、加入適量胰酶（濃度一般為0.25%），使胰酶覆蓋整個(gè)瓶，放入培養(yǎng)箱消化；
4、細(xì)胞消化0.5-2min（具體時(shí)間根據(jù)鏡下形態(tài)判斷），顯微鏡下觀察細(xì)胞，細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間不再連接成片，此時(shí)加入培養(yǎng)基終止消化；
5、用巴氏吸管輕輕吹打細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液1000r/min左右條件下離心3-5min；
6、棄上清，加入適量預(yù)先配制好的凍存液，巴氏吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中的細(xì)胞最終密度為5×106/ml～1×107/ml；
7、將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1-1.5ml；
8、凍存管標(biāo)記細(xì)胞名稱，凍存時(shí)間，操作者及細(xì)胞代數(shù)信息。
對(duì)于懸浮細(xì)胞凍存，則直接收集離心細(xì)胞，除去胰酶消化的步驟，其他步驟相同。
注意事項(xiàng)
1、需凍存保種的細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好且存活率高，其密度約為80-90％的狀態(tài)。細(xì)胞凍存前應(yīng)保證細(xì)胞的活力好，無(wú)污染。
2、在細(xì)胞凍存過(guò)程中，所結(jié)的冰晶對(duì)細(xì)胞傷害較大，所以過(guò)程一定要慢。凍存或者復(fù)蘇最好用新配制的培養(yǎng)液。
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