一、蛋白表達系統(tǒng)概述

蛋白表達系統(tǒng)是指由宿主、外源基因、載體和輔助成分組成的體系。通過這個體系可以實現外源基因在宿主中表達的目的。一般由以下幾個部分組成：
1、宿主。表達蛋白的生物體?？梢詾榧毦⒔湍?、植物細胞、動物細胞等。由于各種生物的特性不同，適合表達蛋白的種類也不相同。
2、載體。載體的種類與宿主相匹配。根據宿主不同，分為原核（細菌）表達載體、酵母表達載體、植物表達載體、哺乳動物表達載體、昆蟲表達載體等。載體中含有外源基因片段。通過載體介導，外源基因可以在宿主中表達。
3、輔助成分。有的表達系統(tǒng)中還包括了協(xié)助載體進入宿主的輔助成分。比如昆蟲-桿狀病毒表達體系中的桿狀病毒。

二、蛋白表達系統(tǒng)種類

（一）大腸桿菌表達系統(tǒng)
在各種表達系統(tǒng)中，更早被采用進行研究的是大腸桿菌表達系統(tǒng)，也是掌握成熟的表達系統(tǒng)，大腸桿菌表達系統(tǒng)以其細胞繁殖快速產量高、IPTG誘導表達相對簡便等優(yōu)點成為生產重組蛋白的常用的系統(tǒng)。
對于表達不同的蛋白，需要采用不同的載體。已知的大腸桿菌的表達載體可分為非融合型表達載體和融合型表達載體兩種。非融合表達是將外源基因插到表達載體強啟動子和有效核糖體結合位點序列下游，以外源基因mRNA的AUG為起始翻譯，表達產物在序列上與天然的目的蛋白一致。融合表達是將目的蛋白或多肽與另一個蛋白質或多肽片段的DNA序列融合并在菌體內表達。融合型表達的載體包括分泌表達載體、帶純化標簽的表達載體、表面呈現表達載體、帶伴侶的表達載體。
大腸桿菌表達系統(tǒng)優(yōu)點在于遺傳背景清楚、繁殖快、成本低、表達量高、表達產物容易純化、穩(wěn)定性好、抗污染能力強以及適用范圍廣等。
（二）酵母表達系統(tǒng)
酵母表達系統(tǒng)作為一種后起的外源蛋白表達系統(tǒng)，由于兼具原核以及真核表達系統(tǒng)的優(yōu)點，正在基因工程領域中得到日益廣泛的應用，應用此系統(tǒng)可高水平表達蛋白，且具有翻譯后修飾功能，故被認可為一種表達大規(guī)模蛋白的強有力的工具。常用的酵母表達系統(tǒng)：
1.釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表達系統(tǒng)：釀酒酵母在釀酒業(yè)和面包業(yè)的使用已有數千年的歷史，被認為是GRAS(generally recognized as safe)生物，不產生毒素，已被美國FDA確認為安全性生物，但釀酒酵母難于高密度培養(yǎng)，分泌效率低，幾乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白質，也不能使所表達的外源蛋白質正確糖基化，而且表達蛋白質的C端往往被截短。因此，一般不用釀酒酵母做重組蛋白質表達的宿主菌
2.甲醇營養(yǎng)型酵母表達系統(tǒng)：甲醇酵母表達系統(tǒng)是應用廣泛的酵母表達系統(tǒng)。甲醇酵母主要有漢森酵母屬(Hansenula)，畢赤酵母屬(Pichia)，球擬酵母屬(Torulopsis)等，并以畢赤酵母屬(Pichia)應用最多。甲醇酵母的表達載體為整合型質粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中，大部分甲醇酵母的表達載體中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因—1(AOX1)，在該基因的啟動子(PAOX1)作用下，外源基因得以表達。甲醇酵母一般先在含甘油的培養(yǎng)基中生長。培養(yǎng)至高濃度。再以甲醇為碳源。誘導表達外源蛋白。這樣可以大大提高表達產量。利用甲醇酵母表達外源性蛋白質其產量往往可達克級。與釀酒酵母相比其翻譯后的加工更接近哺乳動物細胞，不會發(fā)生超糖基化。
酵母表達的特點酵母是一種單細胞低等真核生物，培養(yǎng)條件普通，生長繁殖速度迅速，能夠耐受較高的流體靜壓，用于表達基因工程產品時，可以大規(guī)模生產，有效降低了生產成本。
（三）昆蟲表達系統(tǒng)
昆蟲表達系統(tǒng)是一類應用廣泛的真核表達系統(tǒng)，它具有同大多數高等真核生物相似的翻譯后修飾加工以及轉移外源蛋白的能力。昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)是國內外十分推崇的真核表達系統(tǒng)。利用桿狀病毒結構基因中多角體蛋白的強啟動子構建的表達載體，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表達。它具有真核表達系統(tǒng)的翻譯后加工功能，如二硫鍵的形成、糖基化及磷酸化等，使重組蛋白在結構和功能上更接近天然蛋白；其高表達量可達昆蟲細胞蛋白總量的50%；可表達非常大的外源性基因(一200kD)；具有在同一個感染昆蟲細胞內同時表達多個外源基因的能力；對脊椎動物是安全的。由于病毒多角體蛋白在病毒總蛋白中的含量非常高，至今已有很多外源基因在此蛋白的強大啟動子作用下獲得高效表達。常用的桿狀病毒包括苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)和家蠶型多角體病毒(BmNPV)，常用的宿主細胞則來源于草地夜蛾Sf9細胞，用于表達外源基因的質粒來源于PUC系列，其含有一個多克隆位點和多角體蛋白啟動子。
桿狀病毒系統(tǒng)的主要優(yōu)點包括：
1，組蛋白具有完整的生物學功能，如蛋白的正確折疊、二硫鍵的搭配
2，蛋白翻譯后的加工修飾；
3，表達水平高，可達總蛋白量的50%；
4，可容納大分子的插入片段；
5，能同時表達多個基因。主要缺點是外源蛋白表達處于極晚期病毒啟動子的調控之下，這時由于病毒感染，細胞開始死亡。
（四）哺乳動物表達系統(tǒng)
哺乳動物細胞表達外源重組蛋白可利用質粒轉染和病毒載體的感染。利用質粒轉染獲得穩(wěn)定的轉染細胞需幾周甚至幾個月時間，而利用病毒表達系統(tǒng)則可快速感染細胞，在幾天內使外源基因整合到病毒載體中，尤其適用于從大量表達產物中檢測出目的蛋白。哺乳動物細胞表達載體必須包含原核序列、啟動子、增強子、選擇標記基因、終止子和多聚核苷酸信號等控制元件。
根據目的蛋白表達的時空差異，可將表達系統(tǒng)分為瞬時、穩(wěn)定和誘導表達系統(tǒng)。瞬時表達系統(tǒng)是指宿主細胞在導入表達載體后不經選擇培養(yǎng)，載體DNA隨細胞分裂而逐漸丟失，目的蛋白的表達時限短暫；瞬時表達系統(tǒng)的優(yōu)點是簡捷，實驗周期短。穩(wěn)定表達系統(tǒng)是指載體進入宿主細胞并經選擇培養(yǎng)，載體DNA穩(wěn)定存在于細胞內，目的蛋白的表達持久、穩(wěn)定。由于需抗性選擇甚至加壓擴增等步驟，穩(wěn)定表達相對耗時耗力。誘導表達系統(tǒng)是指目的基因的轉錄受外源小分子誘導后才得以開放。采用異源啟動子、增強子和可擴增的遺傳標記，可提高蛋白產量。
哺乳動物表達系統(tǒng)在蛋白的起始信號、加工、分泌、糖基化方面具有優(yōu)勢，適合表達完整的大分子蛋白。由哺乳動物細胞翻譯后再加工修飾產生的外源蛋白質，在活性方面遠勝于原核表達系統(tǒng)及酵母、昆蟲細胞等真核表達系統(tǒng)，更接近于天然蛋白質，但構成復雜、操作技術要求高、表達產量不大、產率低，且有時會導致病毒感染等是該表達系統(tǒng)的不足之處。
（五）植物表達系統(tǒng)
植物能夠表達來自動物、細菌、病毒以及植物本身的蛋白質易于大規(guī)模培養(yǎng)和生產，且在基因表達與修飾及安全性方面有特別的優(yōu)勢，因此利用植物生產外源蛋白質的研究展現了極其誘人的前景。多種抗體、酶、激紊、血漿蛋白和疫苗等都已通過基因工程的手段在植物的葉、莖、根、果實、種子以及植物細胞和器官中得到表達，然而提取與純化始終是大規(guī)模利用植物生產重組蛋白的主要障礙。Doloressa等據內質網和內質網信號肽在蛋白質合成中的作用，把3種重組蛋白，即嗜熱細菌來源的木聚糖酶、水母的綠色熒光蛋白和人胎盤分泌的堿性磷酸酶(SEAP)定位到質外體中，通過根分泌和葉分泌途徑獲得表達，從而建立了兩種新的重組蛋白表達系統(tǒng)——植物根分泌和葉分泌，簡化了分離和純化程序，為利用轉基因植物大規(guī)模生產重組蛋白提供了潛在的途徑。雖然利用植物表達、生產外源性蛋白起步較晚，但已經能夠利用植物生產多種醫(yī)用、食用以及工業(yè)用蛋白及酶制劑。

三、蛋白表達系統(tǒng)的優(yōu)劣分析

原核蛋白表達系統(tǒng)既是常用的表達系統(tǒng)，也是經濟實惠的蛋白表達系統(tǒng)。原核蛋白表達系統(tǒng)以大腸桿菌表達系統(tǒng)為代表，具有遺傳背景清楚、成本低、表達量高和表達產物分離純化相對簡單等優(yōu)點，缺點主要是蛋白質翻譯后缺乏加工機制，如二硫鍵的形成、蛋白糖基化和正確折疊，得到具有生物活性的蛋白的幾率較小。
酵母蛋白表達系統(tǒng)以甲醇畢赤酵母為代表，具有表達量高，可誘導，糖基化機制接近高等真核生物，分泌蛋白易純化，易實現高密發(fā)酵等優(yōu)點。缺點為部分蛋白產物易降解，表達量不可控。
哺乳動物細胞和昆蟲細胞表達系統(tǒng)主要優(yōu)點是蛋白翻譯后加工機制接近體內的天然形式，最容易保留生物活性，缺點是表達量通常較低，穩(wěn)定細胞系建立技術難度大，生產成本高。
總之，各種表達系統(tǒng)各有優(yōu)缺點，使用大腸桿菌表達系統(tǒng)能夠在較短時間內獲得表達產物，且所需的成本相對較低；但目的蛋白常以包涵體形式表達，產物純化困難，且原核表達系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達產物的生物活性較低。酵母和昆蟲細胞表達系統(tǒng)蛋白表達水平高，成本低，但翻譯后加工修飾體系與哺乳動物不同。哺乳動物表達系統(tǒng)產生的蛋白質更接近于天然狀態(tài)，但表達量低，操作繁瑣。因此，選擇表達系統(tǒng)時，應充分考慮各種因素，如要表達蛋白的性質、生產成本、表達水平、安全性、表達周期等。隨著對外源基因表達系統(tǒng)研究的不斷深入，隨著更多表達機理和影響因素的發(fā)現，相信在不久的將來，原核與真核兩種表達系統(tǒng)在重組蛋白的生產研究中仍然都會占有一席之地，并將出現更多更加完善的表達系統(tǒng)。