朗伯比爾定律(Lambert-Beer law)是分光光度法的基本定律，是描述物質(zhì)對某一波長光吸收的強(qiáng)弱與吸光物質(zhì)的濃度及其厚度間的關(guān)系。

當(dāng)一束平行單色光垂直通過某一均勻非散射的吸光物質(zhì)時(shí),其吸光度A與吸光物質(zhì)的濃度c及吸收層厚度L成正比，而與透過率T成反比。

2                      比爾—朗伯定律數(shù)學(xué)表達(dá)式：

A=lg(1/T)=KLc

A為吸光度，T為透過率，是出射光強(qiáng)度（I）比入射光強(qiáng)度(I0)，T=I/I0。

K為摩爾吸光系數(shù)。它與吸收物質(zhì)的性質(zhì)及入射光的波長λ有關(guān)。

C為吸光物質(zhì)的濃度，單位為mol/L，L為吸收層厚度，單位為cm。

2                      適用條件：

(1) 入射光為平行單色光且垂直照射；

(2) 吸光物質(zhì)為均勻非散射體系；

(3) 吸光質(zhì)點(diǎn)之間無相互作用；

(4) 輻射與物質(zhì)之間的作用僅限于光吸收，無熒光和光化學(xué)現(xiàn)象發(fā)生；

(5) 適用范圍：吸光度在0.2~0.8之間。

01UV測試中的應(yīng)用

由朗伯比爾定律可知，吸光度A與樣品濃度C（同樣厚度）是成正比關(guān)系的，因此這就UV儀器分析中基本理論，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行未知樣品濃度的測定。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)(X)表示可以精確測量的變量(如標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度)，稱為普通變量，縱坐標(biāo)(Y)表示儀器的響應(yīng)值(這里指的是吸光度)，稱為隨機(jī)變量。當(dāng)X取值為X1, X2,…… Xn時(shí)，儀器測得的Y值分別為Y1, Y2, …… Yn。將這些測量點(diǎn)Xi, Yi描繪在坐標(biāo)系中，用直尺繪出一條表示X與Y之間的直線線性關(guān)系，這就是常用的標(biāo)準(zhǔn)曲線法。用作繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，它的含量范圍應(yīng)包括試樣中被測物質(zhì)的含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線不能任意延長。用作繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪圖紙的橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)的標(biāo)度以及實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的大小均不能太大或太小，應(yīng)能近似地反映測量的精度。

02固定波長法

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立（UV定量測試方法的運(yùn)用，以軟件LabSolutions UV-Vis為例）。

圖示：Labsolutions UV-Vis軟件定量法測試界面

圖示：定量[參數(shù)]窗口

選擇“固定波長”，指定波長1的具體波長，右側(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線中“零截距”一般不需要勾選，如果勾選了，標(biāo)準(zhǔn)曲線會(huì)強(qiáng)制過原點(diǎn)（0,0），但實(shí)際測試中，標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距多少還是會(huì)有的，這和標(biāo)準(zhǔn)樣品的空白有較大的關(guān)系。

只有當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)樣品只有一個(gè)時(shí)，這時(shí)如果還需要進(jìn)行測試，可以勾選“零截距”，兩點(diǎn)才能形成一條直線。

03雙波長法

總氮的測定：硝酸根離子在紫外線波長220nm有特征性的量大吸收，但是也有其他溶解性有機(jī)物的干擾，而在275nm波長則基本沒有吸收值。因此，可分別于220和275nm處測出吸光度。A220及A275按下式求出校正吸光度A：

A= A220—2×A275

校正吸光度A與溶液濃度符合朗伯比爾定律，從而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以測試未知樣品濃度。

圖示：[登錄波長]窗口

在“登錄波長”窗口設(shè)置所需要的波長220、275nm。

圖示：定量[參數(shù)]窗口

在定量參數(shù)窗口就要設(shè)置“雙波長差”的計(jì)算方法，并在275nm波長的因子處設(shè)置為2，從而校正吸光度A=AWL220-2×AWL275，其余部分就和單波長測試標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)置類似。后續(xù)測試時(shí)，有個(gè)重要的差異，由于這是雙波長，就需要使用“基線”功能，設(shè)置波長范圍覆蓋220、275nm，例如200~280nm。否則使用“自動(dòng)調(diào)零”的話，就只是當(dāng)前波長調(diào)零，而不能同時(shí)使220、275nm吸光度都調(diào)零。

04K因子測試方法

圖示：定量[參數(shù)]窗口

如果已經(jīng)知道標(biāo)準(zhǔn)曲線的具體公式，可以選擇“指定標(biāo)準(zhǔn)曲線因子（K因子）”法，再指定K0、K1的值，就可以在軟件中生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，后續(xù)直接測試未知樣品的吸光度就能計(jì)算出相應(yīng)的濃度。