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實(shí)時(shí)熒光定量PCR，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。常見的熒光定量PCR檢測(cè)方法有SYBR Green I熒光嵌合法和熒光探針法。
SYBR Green I熒光嵌合法：
熒光探針法：
探針法通常是使用5’端帶有熒光物質(zhì)（如：FAM等），3’端帶有淬滅物質(zhì)（如：TAMRA、Eclipse、BHQ等）的探針進(jìn)行熒光檢測(cè)的方法。當(dāng)探針完整時(shí)，5’端的熒光物質(zhì)受到3’端的淬滅物質(zhì)的制約，不能檢出熒光。探針的報(bào)告基團(tuán)的發(fā)射波長(zhǎng)要在淬滅基團(tuán)的吸收波長(zhǎng)范圍內(nèi)。
能用于實(shí)時(shí)熒光 PCR 定量的方法很多，各有優(yōu)缺點(diǎn)，必須根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)用途進(jìn)行選擇。如果用于區(qū)別同源性高的序列以及進(jìn)行SNP分型解析等多重PCR檢測(cè)，推薦用熒光探針法，而進(jìn)行除此之外的Real Time PCR實(shí)驗(yàn)，我們推薦使用簡(jiǎn)單易行、成本低的SYBR Green I熒光嵌合法。
SYBR Green I熒光嵌合法：
SYBR Green I 是一種能與雙鏈 DNA 結(jié)合發(fā)光的熒光染料。其與雙鏈 DNA 結(jié)合后， 熒光大大增強(qiáng)。因此， SYBR Green I 的熒光信號(hào)強(qiáng)度與雙鏈 DNA 的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號(hào)檢測(cè)出 PCR 體系存在的雙鏈 DNA 數(shù)量。SYBR Green I 的最大吸收波長(zhǎng)約為 497nm，發(fā)射波長(zhǎng)最大約為 520nm。PCR 擴(kuò)增程序一般為 94℃～55℃～72℃三步法，40 個(gè)循環(huán)。SYBR Green I 的缺點(diǎn)：由于 SYBR Green I 沒有特異性，不能識(shí)別特定的雙鏈，只要是雙鏈就會(huì)結(jié)合發(fā)光，對(duì) PCR 反應(yīng)中的非特異性擴(kuò)增或引物二聚體也會(huì)產(chǎn)生熒光，通常本底較高，所以在臨床上使用可能會(huì)有假陽性發(fā)生。
SYBR Green I 的優(yōu)點(diǎn)：SYBR Green I 的優(yōu)點(diǎn)是因?yàn)槠淙秉c(diǎn)產(chǎn)生，由于它能所有的雙鏈DNA相結(jié)合，所以對(duì)不同模板不需特別定制不同的特異性探針，通用性較好，并且價(jià)格相對(duì)較低。這對(duì)科研是很有利的，因此國(guó)內(nèi)外在科研中使用比較普遍。
熒光探針法：
探針法通常是使用5’端帶有熒光物質(zhì)（如：FAM等），3’端帶有淬滅物質(zhì)（如：TAMRA、Eclipse、BHQ等）的探針進(jìn)行熒光檢測(cè)的方法。當(dāng)探針完整時(shí)，5’端的熒光物質(zhì)受到3’端的淬滅物質(zhì)的制約，不能檢出熒光。探針的報(bào)告基團(tuán)的發(fā)射波長(zhǎng)要在淬滅基團(tuán)的吸收波長(zhǎng)范圍內(nèi)。
能用于實(shí)時(shí)熒光 PCR 定量的方法很多，各有優(yōu)缺點(diǎn)，必須根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)用途進(jìn)行選擇。如果用于區(qū)別同源性高的序列以及進(jìn)行SNP分型解析等多重PCR檢測(cè)，推薦用熒光探針法，而進(jìn)行除此之外的Real Time PCR實(shí)驗(yàn)，我們推薦使用簡(jiǎn)單易行、成本低的SYBR Green I熒光嵌合法。
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