β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-GA)活性檢測試劑盒（微量法）

產(chǎn)品貨號：BA1932

產(chǎn)品規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品簡介：

β-1,3-GA( EC 3.2.1.73)主要存在植物中，催化 β-1,3-葡萄糖苷鍵水解。在植物染病或處于其他逆境條件下，可 誘導(dǎo)細(xì)胞大量合成β-1,3-GA，因此β-1,3-GA活性測定廣泛應(yīng)用于植物病理和逆境生理研究。

β-1,3-GA水解昆布多糖，內(nèi)切β-1,3-葡萄糖苷鍵，產(chǎn)生還原末端，通過測定還原糖生成速率，來計(jì)算其酶活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

產(chǎn)品組成：

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前取1支加1mL蒸餾水溶解，用不完的試劑2-8℃保存4周；

2. 標(biāo)準(zhǔn)品：10mg無水葡萄糖。臨用前加入1mL蒸餾水溶解，配制成10mg/mL葡萄糖溶液備用，2-8℃保存2周。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）， 進(jìn)行冰浴勻漿。12000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2. 細(xì)菌或細(xì)胞：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率200w超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；12000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。  

二、測定步驟

1. 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至540nm，分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備：將標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水稀釋至1、0.8、0.6、0.4、0.2mg/mL。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋表。

實(shí)驗(yàn)中每個標(biāo)準(zhǔn)管需35µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

4. 樣本測定（在1.5mL EP管中依次加入下列試劑）：

充分混勻，沸水浴5min（蓋緊，防止水分散失），流水冷卻，取200μL至微量玻璃比色皿或96孔板中，540nm 處記錄各管吸光值A，ΔA=A測定-A對照?？瞻坠芎蜆?biāo)準(zhǔn)曲線只需做1-2次。

如果吸光值大于2，可以用提取液對樣本稀釋后測定。

三、β-1,3-GA活性計(jì)算

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管吸光度 x（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）和濃度（y，mg/mL）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA帶入公式中計(jì)算出樣本中產(chǎn)生的還原糖的含量y值（mg/mL）。

2. β-1,3-GA活性計(jì)算：

（1）按蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每小時產(chǎn)生1mg還原糖定義為一個酶活性單位。

β-1,3-GA (U/mg prot)=(y×V1)÷(V1×Cpr)÷T=y÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算 單位的定義：

每g組織每小時產(chǎn)生1mg還原糖定義為一個酶活性單位。

β-1,3-GA (U/g 質(zhì)量)=(y×V1)÷(W×V1÷V2)÷T=y÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

單位的定義：每1萬個細(xì)胞或細(xì)菌每小時產(chǎn)生1mg還原糖定義為一個酶活性單位。

β-1,3-GA (U/10⁴ cell)=( y×V1)÷(500×V1÷V2)÷T=0.002×y

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.035mL；V2：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W： 樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，60min=1h；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，萬。