表 1.蛋白質免疫印跡檢測方法摘要

4.1.1 增強化學發(fā)光

增強型化學發(fā)光 （ECL） 利用辣根過氧化物酶 （HRP） 或堿性磷酸酶 （AP） 偶聯(lián)的二抗來催化產(chǎn)生光的反應。這是通過過冷CCD傳感器或X射線膠片檢測的，可以可視化印跡。

HRP偶聯(lián)次級因其即時信號生成和比AP偶聯(lián)次級更高的靈敏度而被*廣泛使用。使用AP偶聯(lián)副反應時的另一個考慮因素是它們與磷酸鹽緩沖液不兼容。HRP被疊*化鈉（一種常用的防腐劑）抑制，因此不應與含有NaN的溶液一起使用3.

由于僅發(fā)射單一波長的光，因此不可能進行多重檢測，除非蛋白質靶標以不同的分子量存在，從而可以在同一膜上同時探測多個靶標（例如見圖2）。如果多個靶標的分子量相似，則需要剝離并重新探測印跡。

圖2.使用抗體檢測不同分子量靶標的ECL示例。使用小鼠單克隆抗NFL抗體（HB6433）和小鼠單克隆抗GAPDH（HB9177）探測從各種組織裂解物轉移的蛋白質的膜。使用與HRP偶聯(lián)的山羊抗小鼠多克隆抗體完成可視化。由于NFL和GAPDH的分子量不同，這使得多路復用變得容易。NFL和GAPDH的不同信號強度需要不同的曝光時間，這意味著每個目標都需要單獨的面板。

4.1.2 顯色檢測

顯色檢測利用HRP和AP偶聯(lián)抗體催化反應，導致沉淀到膜上的有色最終產(chǎn)物。HRP的常見底物有：

• 3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）：產(chǎn)生具有高信噪比的藍色產(chǎn)品

• 氯-1-萘醇（4CN）：產(chǎn)生紫藍色產(chǎn)品。但是穩(wěn)定性和靈敏度的問題

• 3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）：產(chǎn)生棕色產(chǎn)品，可使用金屬離子增強。但是穩(wěn)定性有問題。

AP 的常見基板有：

• 硝基藍四唑（NBT）/5-溴-4-氯吲哚磷酸酯（BCIP）：產(chǎn)生強烈的紫色產(chǎn)品，耐褪色。

AP反應可以通過與酸性溶液孵育來停止，因此允許與不同顏色的反應產(chǎn)物進行多重反應。然而，AP共軛次級器件通常不如HRP檢測系統(tǒng)敏感，因此使用頻率要低得多。HRP被疊*化鈉（一種常用的防腐劑）抑制，因此不應與含有NaN的溶液一起使用3.

4.1.3 熒光檢測

熒光檢測利用熒光團偶聯(lián)的二抗來檢測蛋白質條帶。由于PVDF在較低波長下自發(fā)熒光，用于WB檢測的熒光團往往具有高度紅移。ICC/IHC和WB中常用的熒光團列表詳見表1。請參閱成像系統(tǒng)規(guī)格，查找熒光團與激發(fā)/發(fā)射波長兼容的組合。

與ECL相比，熒光檢測的靈敏度較低，但通過使用具有足夠不同的激發(fā)/發(fā)射波長的熒光團可以輕松進行多重檢測。隨著時間的推移，熒光信號也比ECL信號更穩(wěn)定，允許輕松重新成像，同時比ECL檢測變化更小，因為它不依賴于可能受多種因素影響的酶促反應。

4.2 免疫組織化學/免疫細胞化學

免疫組織化學和免疫細胞化學利用熒光或顯色介導的檢測。方法之間的選擇將取決于樣品制備、實驗目標和設備可用性（概述見表2和圖3）。