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抗體的親和層析法純化技術(shù)
實驗原理】
如圖所示，親和層析的高度選擇性使得從某一初始材料中純化，富集某一含量較低的目的蛋白成為可能，因此親和層析是蛋白質(zhì)分離純化過程中zui有效的方法之一。另外，如果配基與蛋白質(zhì)的親和能力很強(qiáng)，也可同時進(jìn)行樣品的濃縮。
雖然多數(shù)情況下不需要將抗體與其他血清蛋白分開，但如果一旦需要，蛋白A親和層析是一種非常有效的分離方法。蛋白A是從Staphylococcus aureus中獲得，可與抗體重鏈的Fc片段相結(jié)合?，F(xiàn)在已知蛋白A可與多種哺乳動物的IgG相結(jié)合也可與某些IgM和IgA相結(jié)合。如果將蛋白A與固相載體相連，例如sepharose CL-4B，這種填料可以成為分離和純化不同類型，不同亞類抗體或抗體片斷的重要工具。
【實驗材料】
⒈.實驗儀器
蛋白A柱（含10ml或5ml填料）；泵；離心管；離心機(jī)；pH試紙；過濾器；玻璃柱。
⒉.實驗試劑
⑴ TBS緩沖溶液：6.06g Tris （50 mM）, 8.78g NaCl （150 mM）以及0.5g*（0.05%）溶于1L蒸餾水中，并用HCl調(diào)節(jié)pH 7.4。
⑵ 中和緩沖溶液：121.2g Tris （1 M）, 87.8g NaCl （1.5 M）, 0.37g EDTA （1mM）及5g*（0.5%）溶于1L蒸餾水中，并用HCl調(diào)節(jié)pH8.0。
⑶ 洗脫緩沖溶液（pH2.7）：將3.75g甘氨酸（50 mM）溶解于1L蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)pH 2.7。
⑷ 洗脫緩沖溶液（pH1.9）：將3.75g甘氨酸（50 mM）溶解于1L蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)pH 1.9。
【實驗方法】
⒈ 準(zhǔn)備蛋白A sepharose CL-4B親和柱
通常準(zhǔn)備5ml或10 ml蛋白A sepharose CL-4B填料，在真空瓶中將等體積的填料和TBS緩沖溶液混合，攪拌。抽真空約15分鐘以除去填料中的氣泡，否側(cè)在柱中形成的氣泡影響柱子的容量和分離效果。將蛋白A sepharose CL-4B填料緩慢加入玻璃柱中，利用泵控制填充速度為1 ml/分-2 ml/分，避免柱干，利用10倍于床體積并經(jīng)過預(yù)冷的TBS緩沖溶液平衡柱子。
⒉ 制備抗血清
將抗血清放入冰水或4oC冰箱中緩慢解凍以避免蛋白質(zhì)的聚集。在蛋白質(zhì)解凍過程中出現(xiàn)的聚集可通過37oC預(yù)熱而溶解。加入固體*至濃度為0.05%，4oC，15,000xg離心5分鐘，移出澄清的抗血清再經(jīng)過濾器過濾除去多余的脂。
⒊ 親和層析
將抗體用TBS緩沖溶液以1：5的比例進(jìn)行稀釋，再用過濾器進(jìn)行過濾。以每分鐘0.5 ml的速度將抗血清上到柱上,為保證抗血清與填料的結(jié)合，需連續(xù)上柱2次并保留上樣流出液。用TBS緩沖溶液清洗柱子至Aλ280nm<0.008后加pH2.7洗脫緩沖溶液，以0.5ml/min的速度洗脫至所有蛋白均流下來。用已經(jīng)加入100ul中和緩沖溶液的1.5 ml EP管分管收集洗脫液，混勻后用pH試紙檢查洗脫液的pH，如果pH低于7可利用中和緩沖液調(diào)至約pH7.4以防止抗體的變性。
在柱中加入10ml，pH1.9洗脫緩沖溶液，按上述方法收集洗脫液至Aλ280nm<0.008。
利用分光光度計測定各管中蛋白質(zhì)的含量。若蛋白濃度低于0.5mg/ml可加入10%的甘油以便保存，將純化的抗體分裝后在2oC~8oC保存。
用含0.05%*的TBS緩沖溶液清洗柱子后將柱子儲存在2oC~8oC環(huán)境。
【實驗結(jié)果】
利用SDS/PAGE檢查洗脫獲得的蛋白純度并利用免疫電泳技術(shù)檢查純化后抗體的滴度。
【注意事項】
⒈ *有毒，應(yīng)戴手套并小心操作
⒉ 在純化過程中，預(yù)冷的TBS緩沖溶液可減少蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合和微生物的代謝。
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