石蠟切片神經(jīng)組織金屬鋅蒂姆（TIMM）染色試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書（中文版）

主要用途

  石蠟切片神經(jīng)組織金屬鋅蒂姆（TIMM）染色試劑是一種旨在使用標(biāo)準(zhǔn)化的化學(xué)分離石蠟方法和蒂姆硫化法銀染技術(shù)，分析存檔中的石蠟包埋的組織切片中神經(jīng)系統(tǒng)中含鋅神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心改良蒂姆（Timm）方法、成功實(shí)驗(yàn)證明的。主要適用于石蠟包埋的腦組織或外周神經(jīng)組織切片，例如海馬（hippocampus）中苔蘚纖維區(qū)（mossy fiber region）和齒狀分子層（dentate molecular layer）等含鋅神經(jīng)細(xì)胞體，例如錐體細(xì)胞（pyramidal cells）、齒狀顆粒細(xì)胞（dentate granule cells）等檢測(cè)。廣泛用于腦理生理，尤其是癲癇等疾病的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，顯色清晰。

技術(shù)背景

蒂姆硫化法銀染（Timm’s sulfide silver staining）是由蒂姆建立的用于觀察腦組織和其它組織中（例如胰腺、小腸、睪丸、腎臟等）微量金屬元素鋅，以及其它重金屬元素，例如銅、鎳、鈷和鐵等的染色技術(shù)。主要用于觀察中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含鋅神經(jīng)元，以及新軸突分枝（sprouted axon）和軸突終端（axon terminal）等結(jié)構(gòu)，分析大腦灰質(zhì)內(nèi)部的海馬中軸突終端（突觸泡囊synaptic vesicle）、苔蘚終端（齒狀顆粒細(xì)胞dentate granule cells）中的反應(yīng)性鋅的分布，與突觸活性和膜去極化的關(guān)系，研究神經(jīng)退行性和癲癇病理性變化機(jī)制。其原理在于使用硫化物，與組織中的游離金屬元素反應(yīng)成為不溶性復(fù)合物沉積，進(jìn)而在還原劑的作用下，金屬硫化物催化還原離子銀為可見(jiàn)金屬銀沉積，呈現(xiàn)黑色，即為金屬自顯影術(shù)（autometallography，AMG）。

產(chǎn)品內(nèi)容

  硫化液（Reagent A）           毫升

  固著液A（Reagent B）          毫升

  固著液B（Reagent C）              毫升

  脫蠟液（Reagent D）                毫升（自備）

  補(bǔ)水液A（Reagent E）          毫升

  補(bǔ)水液B（Reagent F）          毫升

  補(bǔ)水液C（Reagent G）          毫升

  清理液（Reagent H）           毫升

  染色液A1（Reagent I1）              毫升

  染色液A2（Reagent I2）              瓶

  染色液A3（Reagent I3）              毫升

  染色液B（Reagent J）          微升

產(chǎn)品說(shuō)明書              1份

保存方式

保存  染色液A1（Reagent I1）在—20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，避免光照；有效保證3月

用戶自備

PBS緩沖液：用于灌注

無(wú)離子水：用于組織清洗

1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器

無(wú)菌鑷子：用于轉(zhuǎn)移動(dòng)物腦組織

小型玻璃染色缸：用于組織或切片處理的容器

切片機(jī)：用于組織切片

明膠化載玻片和蓋玻片：用于切片后鋪片

中性樹脂：用于切片封片

光學(xué)顯微鏡：用于切片染色后觀察分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 樣本固著處理

1． 常規(guī)麻醉動(dòng)物和手術(shù)（建議：使用PBS由心臟處灌注約5至10分鐘，去除血液直至澄清，肝臟顯示灰白）

2． 使用適量的  硫化液（Reagent A）灌注處理（建議：至少10分鐘，肝臟顯示發(fā)黑）

3． 即刻小心取出腦組織（組織顯示藍(lán)灰色調(diào)）

4． 小心放進(jìn)xx毫升  硫化液（Reagent A）里

5． 室溫下浸泡孵育45分鐘

6． 即刻用無(wú)菌鑷子夾起組織塊 

7． 放進(jìn)用戶自備的無(wú)離子水清洗2分鐘

8． 小心轉(zhuǎn)移到xx毫升  固著液A（Reagent B）里

9． 室溫下浸泡孵育過(guò)夜（16小時(shí)）

10． 小心轉(zhuǎn)移到xx毫升  固著液B（Reagent C）里

11． 室溫下浸泡孵育過(guò)夜（16小時(shí)）

12． 用綿紙吸干組織快

13． 即刻進(jìn)行常規(guī)乙醇和氯甲烷（氯仿類）處理后石蠟包埋

14． 取出組織塊，進(jìn)行緩慢石蠟切片，為10至50微米厚，并鋪片在明膠化載玻片上

二、 脫蠟處理

1． 取出10片待測(cè)的10至50微米厚的石蠟包埋的組織切片

2． 按下表依次放進(jìn)小染色缸里孵育

5． 小心移去切片上的  清理液（Reagent H）

三、 樣本染色處理

染色開(kāi)始前，將  染色液A1（Reagent I1）置于室溫下均衡溫度，然后移取xx毫升  染色液A3（Reagent I3）到1瓶  染色液A2（Reagent I2），充分混勻后，再加入到1瓶  染色液A1（Reagent I1）中，充分混勻；然后移取2毫升染色液A混勻液到2.2毫升離心管，加入xx微升  染色液B（Reagent J），混勻后，標(biāo)記為  染色工作液（10張切片染色），置于暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作

1． 小心加上xx微升  染色工作液，鋪滿整個(gè)切片樣品表面

2． 室溫下孵育60至90分鐘，或直至呈現(xiàn)黑色，即可終止，避免光照

3． 小心移去切片上的  染色工作液

4． 室溫下，小心將切片置入xx毫升  清理液（Reagent H）中孵育5分鐘

5． 小心移去切片上的  清理液（Reagent H）

6． （選擇步驟）進(jìn)行復(fù)染操作（建議使用  甲苯酚紫（CRESYL VIOLET）復(fù)染試劑盒－GMS80052）

7． 透明處理

8． 放上蓋玻片或封片（中性樹脂）

9． 即刻在一般光學(xué)顯微鏡下觀察：含鋅神經(jīng)細(xì)胞體，例如錐體細(xì)胞、齒狀顆粒細(xì)胞、突觸泡囊等，呈現(xiàn)黑色（如果復(fù)染――細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，胞漿尼氏（體）物質(zhì)呈現(xiàn)粉紅至紫色）

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為10次操作，其中20次染色操作

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 鋪片須使用明膠化載玻片，否則染色會(huì)掉片：第一用毛筆涂刷；第二保持濕潤(rùn)3小時(shí)；第三用PARAFIN包裹后壓片

4． 切片建議10至50微米，過(guò)厚和過(guò)薄不利于檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞

5． 注意操作安全，尤其使用  固著液（Reagent B和C）和  脫蠟液（Reagent D）

6． 用戶可以使用二甲苯替代  脫蠟液（Reagent D）

7． 建議使用玻璃染色缸

8．   染色液A混勻液新鮮配制，不宜保存

9． 每次更換試劑溶液時(shí)，保持切片面基本晾干

10． 試劑溶液在切片表面時(shí)，避免有氣泡存在，同時(shí)確保鋪滿切片表面

11． 整個(gè)操作，在避光狀態(tài)下進(jìn)行

12． 染色完成后，即刻進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察 

13． 樣品染色后保存，避免光照

14． 參考圖像如下

15． 本公司提供系列神經(jīng)系統(tǒng)成分染色試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定顯色清晰