手機(jī)版
化工儀器網(wǎng)手機(jī)版
化工儀器網(wǎng)小程序
官方微信
公眾號：chem17
掃碼關(guān)注視頻號
Trizol法RNA提取的實(shí)驗(yàn)流程和注意事項(xiàng)
Trizol是一種酸性試劑，能從細(xì)胞和組織中快速分離RNA，其主要成分為異硫氰酸胍(GITC)和苯酚。裂解細(xì)胞后，GITC能使蛋白質(zhì)和RNase變性，有利于保護(hù)RNA的完整性；加入氯仿離心后，樣品分為水相和有機(jī)相，RNA存在于上層水相中，而DNA和蛋白質(zhì)則存在于中間層及下層有機(jī)相中，從而達(dá)到分離的目的。簡單來講就是裂解細(xì)胞使RNA得以釋放，加之有機(jī)溶劑使RNA與DNA、蛋白質(zhì)分離，并進(jìn)一步純化得到RNA的過程。那么你知道Trizol法RNA提取的實(shí)驗(yàn)流程和注意事項(xiàng)是什么嗎？讓我們一起來看看吧！
1.樣品的制備
1)細(xì)胞：按1ml Trizol試劑/5-10×10^6細(xì)胞的比例加入Trizol試劑(注：一般來講待細(xì)胞在六孔板上生長至80%左右時(shí)，每孔收集的細(xì)胞加1ml Trizol即可)；
2)組織：按1ml Trizol試劑/50-100mg組織的比例加入Trizol試劑并在冰上勻漿處理，以利于RNA的釋放(注：組織可以先用液氮急凍后研磨處理，也可用勻漿器或者組織研磨器進(jìn)行處理，但要注意保持低溫，以防RNA降解)；
室溫裂解5-10min。
2.氯仿抽提
每1ml Trizol中加入200ul的氯仿，蓋好EP管蓋后用手劇烈顛倒混勻15s左右，室溫孵育2-3min。2-8℃，12000g離心15min后溶液分為三層，從上到下依次為水相(RNA)、中間層及有機(jī)相(DNA、蛋白質(zhì)等)，轉(zhuǎn)移水相至新的EP管中(注：此步一定要小心謹(jǐn)慎，慢慢吸取，不可觸及中間層，以免RNA被污染)。
3.異丙醇沉淀
每1ml Trizol中加入500ul異丙醇，上下顛倒混勻后，室溫孵育10min，2-8℃，12000g離心10min，得到的白色沉淀即為RNA沉淀(注：異丙醇最好提前預(yù)冷，維持低溫環(huán)境，以防RNA被降解)。
4.乙醇洗滌
棄去上清，加入1ml 75%乙醇(每1ml Trizol)洗滌RNA沉淀，2-8℃，7500g離心5min(注：75%乙醇可以用無水乙醇及無酶水來配制，同樣最好預(yù)冷處理；清洗時(shí)動(dòng)作要輕柔，過于劇烈會(huì)導(dǎo)致RNA沉淀散開，再次離心未免會(huì)重聚，從而造成RNA的損失)。
5.溶解
棄去上清，于通風(fēng)櫥內(nèi)干燥RNA沉淀5-10min，用50ul左右的無酶水重懸沉淀，即可得到RNA溶液(注：干燥時(shí)間不可過長，太過干燥會(huì)導(dǎo)致沉淀很難溶解，部分溶解的RNA的260/280的比值會(huì)大大降低，甚至低于1.6；亦可采用金屬浴60℃，5min以助溶)。
6.RNA質(zhì)量的檢測
1)微量分光光度計(jì)
純RNA的260/280比值在2.0左右，若比值偏小，則代表可能有蛋白或有機(jī)溶劑的污染，比值偏大則代表RNA可能發(fā)生降解。
2)瓊脂糖凝膠電泳
可見三條帶，從上往下一般為28s RNA、18s RNA及5s RNA，一般情況下5s的帶非常淡，甚至看不清，28s帶的亮度應(yīng)為18s帶亮度的2倍，且不存在拖尾，即可證明RNA純度可以，如若5s很明顯，而28s 與18s帶的亮度并無太大差別，甚至出現(xiàn)涂抹狀的條帶則高度提示RNA降解。
更多有關(guān)Trizol法RNA提取的實(shí)驗(yàn)流程和注意事項(xiàng)，請聯(lián)系天津益元利康生物科技有限公司。
相關(guān)產(chǎn)品
免責(zé)聲明
- 凡本網(wǎng)注明“來源：化工儀器網(wǎng)”的所有作品，均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品，未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的，應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用，并注明“來源：化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者，本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任。
- 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來源（非化工儀器網(wǎng)）的作品，目的在于傳遞更多信息，并不代表本網(wǎng)贊同其觀點(diǎn)和對其真實(shí)性負(fù)責(zé)，不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任。其他媒體、網(wǎng)站或個(gè)人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時(shí)，必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來源，并自負(fù)版權(quán)等法律責(zé)任。
- 如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請?jiān)谧髌钒l(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系，否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。
采購中心