使用化學(xué)限定培養(yǎng)基來控制質(zhì)量穩(wěn)定性和降低生產(chǎn)成本是目前大部分生物制藥企業(yè)所追求的，但是有一些細(xì)胞的培養(yǎng)還是離不開在培養(yǎng)基中添加血清。本研究發(fā)現(xiàn)，不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同濃度的血清，使用Rebel儀器仍然能獲得準(zhǔn)確的氨基酸代謝趨勢數(shù)據(jù)。

一、       比較基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基與添加了10%胎牛血清的成分濃度差異

背景：DMEM、IMDM和RPMI是細(xì)胞培養(yǎng)過程中使用的三種最常見的細(xì)胞培養(yǎng)基配方。這些化學(xué)定義的培養(yǎng)基是無蛋白質(zhì)，含有氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和其他成分的特定配方，以適應(yīng)細(xì)胞系的營養(yǎng)需求。對于某些類型的細(xì)胞培養(yǎng)和過程（例如，干細(xì)胞、T和B細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、白血病細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等），這些基礎(chǔ)培養(yǎng)基通常添加10% v/v的胎牛血清（FBS）。胎牛血清的添加補(bǔ)充了維持細(xì)胞活力和生長所必需的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和生長因子，并使培養(yǎng)物適應(yīng)pH值、溫度、滲透壓或其他培養(yǎng)動態(tài)的變化。然而，添加胎牛血清的培養(yǎng)基對傳統(tǒng)色譜方法具有挑戰(zhàn)性。血清蛋白會干擾色譜法。用蛋白質(zhì)沉淀制備樣品可能會干擾培養(yǎng)基組分的回收率，導(dǎo)致新鮮培養(yǎng)基或反應(yīng)液的結(jié)果有偏倚。

實(shí)驗(yàn)：一種不含谷氨酰胺和細(xì)胞培養(yǎng)級胎牛血清（美國來源）的DMEM、IMDM和RPMI培養(yǎng)基按以下方法進(jìn)行了測試。所有的培養(yǎng)基樣品都按照制造商的說明進(jìn)行處理。最終溶液稀釋10倍后，沒有額外的樣品制備。

添加和不添加10%胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的培養(yǎng)基成分濃度。誤差條來自于5次重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

結(jié)論：當(dāng)比較添加和不添加胎牛血清補(bǔ)充劑的標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分時，每種培養(yǎng)基的培養(yǎng)基成分水平幾乎沒有差異。對于DMEM培養(yǎng)基，不添加胎牛血清的配方非常相似，在實(shí)驗(yàn)誤差范圍內(nèi)。然而，補(bǔ)充10%的血清后均檢測到低水平的Ala、Glu和Pro。這三種氨基酸在DMEM配方中不存在，因此補(bǔ)充胎牛血清后的結(jié)果表明這些成分的添加量非常低。有和無血清的IMDM培養(yǎng)基均無明顯變化。RPMI培養(yǎng)基在配方中不含Ala，但在10%胎牛血清補(bǔ)充樣品中檢測到Ala。與DMEM的結(jié)果一樣，這表明從胎牛血清中添加的少量Ala足夠多，可以在補(bǔ)充血清的培養(yǎng)基樣本中檢測到。使用REBEL，人們可以在血清添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方時常規(guī)監(jiān)測培養(yǎng)基成分的這些輕微變化。這種做法可以支持多種細(xì)胞系的培養(yǎng)過程和培養(yǎng)基準(zhǔn)備。

二、比較添加不同量的胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基的成分濃度差異

背景：RPMI培養(yǎng)基是常用的化學(xué)定義和無蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基之一，因?yàn)樗m用于多種哺乳動物細(xì)胞系（如干細(xì)胞、T和B細(xì)胞、雜交瘤、HEK293、THP-1白血病細(xì)胞等）。RPMI培養(yǎng)基中通常添加1-10%水平的胎牛血清（FBS），以補(bǔ)充維持特定細(xì)胞系過程所必需的生長因子。然而，當(dāng)需要對培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)的定量分析時，F(xiàn)BS補(bǔ)充的培養(yǎng)基就會出現(xiàn)一些問題。混合培養(yǎng)基中高血清蛋白含量可能會干擾氨基酸分析的標(biāo)準(zhǔn)色譜柱。在用傳統(tǒng)的色譜平臺進(jìn)行分析之前，可能需要用沉淀法去除蛋白質(zhì)來制備樣品。這種額外的樣品準(zhǔn)備可能會影響氨基酸回收率，導(dǎo)致傳統(tǒng)的介質(zhì)分析方法的偏倚結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)：將市售的RPMI培養(yǎng)基（不含谷氨酰胺）和細(xì)胞培養(yǎng)級胎牛血清（美國來源）混合在以下水平上。所有的培養(yǎng)基樣品都按照制造商的說明進(jìn)行處理。最終溶液在用REBEL進(jìn)行分析前稀釋10倍，沒有額外的樣品制備。

添加胎牛血清的RPMI和RPMI的培養(yǎng)基成分濃度。誤差條來自于6次重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

結(jié)論：該分析能夠在單一稀釋水平上定量24種不同的培養(yǎng)基組分，包括19種氨基酸。在堿性RPMI培養(yǎng)基和添加高達(dá)10%胎牛血清的RPMI樣品之間，培養(yǎng)基成分的濃度幾乎沒有差異。Ala和Gln例外。Ala和Gln都不在RPMI的原始配方中。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基和1%胎牛血清補(bǔ)充的培養(yǎng)基中均未檢測到。然而，在5%和10%的胎牛血清中，Ala和Gln都被鑒定出來，這與在稀釋10倍后的純血清中檢測這兩種氨基酸的單獨(dú)觀察結(jié)果一致（未顯示）。與配方相對應(yīng)，精氨酸在所有氨基酸里濃度最高，平均為2.108 mM。相比之下，色氨酸的濃度較低，平均為0.011 mM。使用Rebel，可以快速和自信地篩選補(bǔ)充血清的培養(yǎng)基配方，以確保在引入細(xì)胞培養(yǎng)基之前批量培養(yǎng)基的一致性。

三、比較添加不同量的胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基的成分濃度差異

背景：IMDM是杜DMEM的一種氨基酸、維生素和無機(jī)鹽富集版本。IMDM通常用于成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞系（如COS-7）、造血干細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞（如Jurkat細(xì)胞）的高密度細(xì)胞培養(yǎng)。由于IMDM是一種化學(xué)定義的培養(yǎng)基，它缺乏生長因子、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。為了支持細(xì)胞生長，IMDM通常補(bǔ)充胎牛血清（FBS）（如1-10%），這取決于細(xì)胞系。當(dāng)使用化學(xué)定義的細(xì)胞培養(yǎng)基，如IMDM補(bǔ)充胎牛血清，培養(yǎng)基分析可能是一個負(fù)擔(dān)。在用標(biāo)準(zhǔn)色譜柱添加的胎牛血清中高水平的蛋白質(zhì)之間出現(xiàn)干擾?？赡苄枰~外的樣品制備來去除和沉淀樣品介質(zhì)中的蛋白質(zhì)。這些增加的步驟可能會影響微量介質(zhì)成分（如氨基酸和維生素）的回收率，導(dǎo)致介質(zhì)分析的傳統(tǒng)分析方法的問題。

實(shí)驗(yàn)：不含谷氨酰胺的商業(yè)IMDM培養(yǎng)基和細(xì)胞培養(yǎng)級胎牛血清（美國來源）按以下水平混合。所有的培養(yǎng)基樣品都按照制造商的說明進(jìn)行處理。最終溶液在用Rebel進(jìn)行分析前稀釋20倍，沒有額外的樣品制備。

添加胎牛血清的IMDM和IMDM的培養(yǎng)基成分濃度。誤差條來自于6次重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

結(jié)論：用Rebel稀釋劑單次稀釋20倍后，分析結(jié)果能夠定量24種不同的培養(yǎng)基成分，包括18種氨基酸和3種B族維生素。在單獨(dú)添加堿性IMDM培養(yǎng)基和添加高達(dá)10%胎牛血清的IMDM樣品之間，培養(yǎng)基成分的濃度幾乎沒有差異。在這些氨基酸中，色氨酸的平均濃度較低，平均為0.032 mM，賴氨酸的平均濃度最高，為1.165 mM。維生素B1（硫胺素）是所有培養(yǎng)基成分中檢測到的較低濃度，平均濃度為0.004 mM。GABA和βAla并不普遍存在于所有化學(xué)定義的培養(yǎng)基配方中，兩者在所有樣品的平均濃度分別為0.028 mM和0.030 mM。有了REBEL，可以快速地篩選添加血清的培養(yǎng)基配方。

四、Sf9和Sf21昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基中必需氨基酸含量的比較

背景：Sf9和Sf21等昆蟲細(xì)胞系最初是從果蛾中分離出來的。它們通常用于重組蛋白表達(dá)、疫苗開發(fā)和病毒載體生產(chǎn)。這些細(xì)胞系非常適應(yīng)貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)，以及傳統(tǒng)的血清培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基和無蛋白培養(yǎng)基。選擇合適的培養(yǎng)基是基于多種條件的，但其中最重要的就是氨基酸含量。許多氨基酸不是由昆蟲細(xì)胞合成的，有些氨基酸對于添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中以獲得最佳的生長和/或蛋白質(zhì)生產(chǎn)是至關(guān)重要的。了解昆蟲細(xì)胞代謝，并了解細(xì)胞培養(yǎng)基中氨基酸的含量，可以采用更明智的過程開發(fā)分析策略，將細(xì)胞生長/活力和生產(chǎn)力的變化與培養(yǎng)基中的營養(yǎng)含量聯(lián)系起來。

實(shí)驗(yàn)：本研究使用了三種不同的細(xì)胞培養(yǎng)基，分別用于Sf9或Sf21昆蟲細(xì)胞系的生長。測試的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基包括傳統(tǒng)培養(yǎng)基、化學(xué)定義的培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)基樣品均按照制造商的說明進(jìn)行處理。樣品在REBEL分析前稀釋100倍，沒有額外的樣品制備。為簡單起見，只顯示了三種培養(yǎng)基的必需氨基酸進(jìn)行比較。

來自傳統(tǒng)、化學(xué)定義和無血清昆蟲培養(yǎng)基的必需氨基酸圖譜。誤差條來自于5次重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差

結(jié)論：所有必需氨基酸的含量都不同。與化學(xué)定義的和無血清培養(yǎng)基相比，傳統(tǒng)培養(yǎng)基的His水平明顯高7.4倍和11.3倍。然而，傳統(tǒng)培養(yǎng)基中的五種氨基酸水平低——Ile、Leu、Met、Phe和Val?；瘜W(xué)定義的培養(yǎng)基中Ile、Lys、Met、Phe、Trp和Val的水平最高。此外，它與無血清培養(yǎng)基的高水平并列。除了Leu，無血清培養(yǎng)基中所顯示的其他必需氨基酸的第二或第三多。這一簡短的分析說明了考慮測量昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基中氨基酸的組成是如何至關(guān)重要的。

使用方法和樣品處理：

你所看到的就是你所得到的。

REBEL側(cè)面不需要外部計(jì)算機(jī)、壓縮氣瓶、廢物或者試劑瓶。

您需要做的只是，取品(1)后離心或過濾以除去細(xì)胞，并用REBEL稀釋液(2)稀釋。然后將樣品載入設(shè)備(3)，按“start”(4)。所有的校準(zhǔn)劑和試劑都放在REBEL儀器內(nèi)部，數(shù)據(jù)將被自動處理成報(bào)告（CSV或PDF），可用U盤導(dǎo)出(5)。