細胞炎性壞死 (焦亡) 常伴隨著線粒體的損傷，這一切的背后到底是道德的淪喪還是……咳咳咳，這究竟是巧合還是早有預謀？讓我們隨著小 M 來探索一下其中的奧秘吧~

細胞焦亡又稱細胞炎癥性壞死，一種程序性細胞死亡方式，由炎癥小體的活化及炎癥性半胱天冬酶的激活引起，是機體免疫系統(tǒng)對抗外源病原菌入侵的主要手段之一[1][2][3][4]。往期研究發(fā)現(xiàn) GSDMD/E 介導的細胞焦亡早期伴隨線粒體損傷發(fā)生，但其潛在機制和功能尚不清楚[5]。

近期，Miao 等人發(fā)表在 Immunity 的研究報道了 GSDMD 介導線粒體損傷的分子機制！對細胞死亡和炎癥來說，線粒體損傷是一條"不歸路"：激活的 Gasdermins 結(jié)合到線粒體的心磷脂，形成線粒體孔道，這將破壞兩個線粒體膜，導致活性氧的產(chǎn)生，氧化磷酸化的喪失，細胞毒性介質(zhì)的釋放，以及線粒體自噬[1]。

GSDMD 介導線粒體損傷的分子機制[1]。

科學不廢話！各位看官，來一來，瞅一瞅，走過路過不要錯過哈哈哈，讓我們一起瀏覽一下吧~~

? 線粒體受損：評估線粒體敏感性和膜電位
研究人員使用 LPS + Nigericin 聯(lián)合處理 THP-1 巨噬細胞，結(jié)合染料 MTDR、MTG 以及 TMRM 進行染色，評估線粒體膜的電位和完整性 (圖 1A-B)。與鄰近的 SYTOX 或 PI 陰性活細胞相比，SYTOX 或 PI 陽性的焦亡細胞的 MTDR 和 TMRM 熒光明顯減弱，而 MTG 染色持續(xù)存在，表明線粒體在焦亡過程中去極化。

圖 1. 細胞焦亡對線粒體損傷的影響^[1]。

(A) 用 MitoTracker 深紅 (MTDR)、MitoTracker 綠 (MTG) 和 PI 染色的 LPS + Nigericin 處理的 THP1 的共聚焦熒光活細胞圖像。白色箭頭表示焦亡細胞。(B) 黑色箭頭表示正常線粒體；黃色箭頭，線粒體嵴缺失或膜損傷；紅色箭頭，自噬體內(nèi)受損的線粒體。

同時，在添加 Nigericin 引發(fā)焦亡前后，用透射電子顯微鏡觀察 LPS 原生的 THP-1 細胞，可以看到線粒體形態(tài)發(fā)生了變化 (圖 1C-D)：

• 添加前：線粒體呈典型的卵形，由雙膜囊泡和內(nèi)部嵴狀結(jié)構(gòu)組成，但在添加后，線粒體收縮并圓潤起來，平均長度減少約 2 倍 。

• 添加后 15 min 內(nèi)，觀察到含有損傷線粒體的自噬體。1 h 后，約 60% 的線粒體具有旋轉(zhuǎn)或消失的嵴狀結(jié)構(gòu)和/或破裂的內(nèi)線粒體膜 (IMM) 和外線粒體膜 (OMM)，線粒體數(shù)量減少約 2 倍。

在引發(fā)焦亡后的早期階段，線粒體受到了嚴重損害。此外，活化的 GSDMD-NT 會轉(zhuǎn)位至線粒體并在其膜上成孔，導致線粒體膜通透。

?  細胞先發(fā)生焦亡？還是線粒體損傷 ？

研究人員評估了 LPS + Nigericin 處理過的 THP-1 細胞中的線粒體膜電位 (TMRM 強度)、細胞 ROS 產(chǎn)生 (DCFDA 強度) 和質(zhì)膜通透性 (SYTOX Green攝取) (圖 2A)。DCFDA 增加而 TMRM 降低發(fā)生在細胞攝取 SYTOX Green 之前，證實了線粒體功能不全在細胞死亡之前發(fā)生。

流式細胞術(shù)對 MitoSOX (線粒體 ROS)、DiIC1(5) (線粒體膜電位) 和 SYTOX Green 攝取進行的檢驗也證實了這一點 (圖 2B)。在 SYTOX Green 攝取之前約 10 min 就能檢測到 MitoSOX 和 DiIC1(5) 的顯著變化。

圖 2. 線粒體損傷發(fā)生在質(zhì)膜損傷前，并增強焦亡^[1]。

(A) 利用酶標儀對 LPS 或 LPS+Nigericin (Ng) 處理的 THP-1 中的 DCF 和 TRM 強度以及 SYTOX Green 攝取進行動力學分析。(B) LPS+Nigericin (Ng) 處理的 THP1 處理后用 MitoSOX、DiIC1(5) 或 SYTOX Green 染色的的流式細胞術(shù)直方圖（上）和多個樣品的定量（下）分析結(jié)果。P，陽性對照（抗霉素 A處理檢測 MitoSOX，CCCP 處理檢測 DiIC1(5)，Triton X-100 處理檢測 SYTOX Green）；UNT，未經(jīng)治療。

同時，使用溴化乙錠 (EB) 處理 iBMDMs (永生化小鼠骨髓來源巨噬細胞) 以生成缺少線粒體的 ρ° 細胞。經(jīng)檢測，發(fā)現(xiàn) ρ° 細胞對于經(jīng)典及非經(jīng)典的焦亡途徑炎癥小體誘導的焦亡具有抗性，線粒體缺陷會顯著降低細胞焦亡誘導，表明線粒體在焦亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，胞質(zhì) ROS 可放大經(jīng)典和非經(jīng)典炎癥小體介導的細胞焦亡。

? GSDMD-NT 在質(zhì)膜破裂前轉(zhuǎn)移并損傷線粒體

為了確定在活細胞中 GSDMD-NT 是否結(jié)合并介導線粒體功能障礙，我們對表達多西環(huán)素 (DOX) 誘導的 I105N GSDMD-NT 的 iBMDMs 進行了成像，該 GSDMD-NT 在其 C 末端融合了藍色熒光蛋白 (GSDMD-NT-BFP)。I105N 突變使焦亡速度減慢，從而使得更好地檢測到死亡細胞。

I105N GSDMD-NT-BFP 的 iBMDMs:

iBMDMs, Immortalized bone marrow derived macrophages，永生化骨髓源性巨噬細胞。作者使用了來自表達 Cas9 的小鼠的永生化骨髓源性巨噬細胞 (iBMDM)，即 Cas9 KI iBMDM。

作者在 Cas9 KI iBMDM 中穩(wěn)定表達了 Tet3G 反式激活子，以及在 Cas9 KI Tet3G 穩(wěn)定細胞中產(chǎn)生多西環(huán)素 (Dox) 誘導型 GSDMD 變體，這使得編碼 NT-GSDMD 和全長 GSDMD (FL-GSDMD) 的轉(zhuǎn)基因能夠通過Dox 誘導表達。其中包含 C 端 BFP 標簽。利用了包含 I105N 突變的 NT-GSDMD 變體 (已被證明可以防止巨噬細胞焦亡)，因為這種突變體比其野生型 (WT) 對應(yīng)物更容易在細胞內(nèi)檢測到[7][8]。

研究表明早期的 GSDMD-NT定位到線粒體 (圖 3 A-E)。在 DOX 誘導后 4-8 h，可以檢測到 GSDMD-NT-BFP。通過活細胞共聚焦成像觀察了添加 DOX 后 6 小時開始的 GSDMD-NT 定位、質(zhì)膜通透性 (PI 或 SYTOX 攝取) 和線粒體損傷 (MitoTracker、TMRM 和 MitoSOX) 的動態(tài) (圖 3A，3B)。

圖 3. GSDMD-NT 在質(zhì)膜前易位并損傷線粒體^[1]。

(A 和 B) 通過DOX 誘導穩(wěn)定表達 GSDMD-NT(I105N)-BFP 的 iBMDM，利用MitoTracker Deep Red 和 PI（左）、TMRM 和 SYTOX Deep Red (SYTOX DR)（中）或 MitoSOX Red 和 PI（右） 進行活細胞成像用評估線粒體損傷和細胞死亡，在添加 DOX 后 6 小時開始成像。時間 0 表示檢測到細胞中的 PI 或 SYTOX（藍色虛線)。

通過定義每個細胞在檢測到染料攝取 (質(zhì)膜損傷) 時的時間為 0 來同步焦亡變化：在 DOX 后，最終經(jīng) PI 或 SYTOX 攝取評估死亡的 GSDMD-NT-BFP 表達細胞中，MitoTracker 和 TMRM 強度都降低了(圖 3A 和 3B)，而在表達 FL-GSDMD-BFP 的細胞中，線粒體染料強度和 PI 攝取保持不變 (圖 S2C-2F)。GSDMD-NT-BFP 至少在質(zhì)膜通透性增加前 50 分鐘就與線粒體染料定位在一起 (圖3A 和 3B)，確認了早期的 GSDMD-NT 定位到線粒體。當然，作者也通過進一步的成像實驗證實 GSDMD-NT 與線粒體的共定位 (此處不再詳細展開)。

插一句：換個思路想，這就好比談戀愛， A 和 B 分手了，B 立刻就和 C 在一起了，說明啥？B 和 C 肯定早就在一起了嘛！哈哈哈哈僅供理解，不可細究喔~

此外，MitoTracker 和 TMRM 強度逐漸下降，而 MitoSOX 信號在 PI 或 SYTOX 攝取之前增加。所有線粒體標記最終消失，暗示線粒體溶解。在焦亡晚期，質(zhì)膜已經(jīng)被滲透后，從受損線粒體釋放出 MitoSOX Red。也就是說，細胞焦亡早期，GSDMD-NT 會首先轉(zhuǎn)位至線粒體，且在細胞膜成孔之前，造成線粒體損傷。

? GSDMD-NT 直接使 OMM 和 IMM 通透

為了確定 GSDMD-NT 是否自身就能結(jié)合并損傷線粒體膜，作者從 HCT116 (A-C)或 iBMDMs (D-E) 中分離出線粒體，在存在或不存在 z-VAD-FMK (泛 Caspase 抑制劑) 或 Disulfiram (DSF, GSDMD 孔形成的有效抑制劑) 的情況下，用 GSDMD 和/或 Caspase-11 或 t-Bid 處理。GSDMD 和 Caspase-11 處理可產(chǎn)生活性的 GSDMD-NT，并通過免疫印跡檢測釋放的線粒體蛋白以評估線粒體通透性 (圖 4A 和 4B)。

圖 4. GSDMD-NT 可通透并損傷分離的線粒體^[1]。

(A、B 和 D) 處理后通過免疫印跡檢測上清液或線粒體的蛋白 (A 和 D) 以及多個實驗的光密度測定 (B)。(C 和 E) 通過 qPCR 檢測上清液中的 mtDNA。

研究表明，GSDMD-NT 直接使 OMM 和 IMM 通透，而不需要其他因素。

• 添加 Caspase-11 和 GSDMD 后 5 分鐘內(nèi)，可溶性線粒體基質(zhì)蛋白 ACO2 和線粒體膜間隙蛋白 (IMS 蛋白：Cytochrome C 和 HtrA2) 從線粒體中釋放出來，而與膜結(jié)合的 COX IV 則沒有。泛 Caspase 抑制劑 z-VAD-FMK 抑制了釋放。

• 在添加 t-Bid 后，觸發(fā)凋亡中的 MOMP (線粒體外膜通透化) 而不破壞 IMM (線粒體內(nèi)膜)，釋放出了 Cytochrome C 和 HtrA2，但沒有釋放 ACO2 (圖 4A-B)。

• 當線粒體與 GSDMD 和 Caspase-11 一起孵育時，也釋放出 mtDNA，但是單獨添加它們或者添加 t-Bid 時則沒有 (圖 4C)。

• 同時，處理分離的線粒體的 GSDMD 和 Caspase-11 也顯著增加了 ROS，并通過 MitoSOX Red 和 DiIC1(5) 染色分別降低了膜電位 (圖中未顯示)。

此外，Disulfiram 抑制 GSDMD 孔洞形成，但不干擾 GSDMD 切割或 GSDMD-NT 與膜的結(jié)合。在添加 GSDMD 和 Caspase-11 之前預先用 DSF 孵育分離的線粒體 (圖 4D-E)。DSF 阻止了 Cytochrome C 和 mtDNA 的線粒體釋放，證實了 GSDMD-NT 孔洞使線粒體通透。

? OMM 心磷脂是 GSDMD 介導的線粒體損傷所必須的
心磷脂是由 CRLS1 合成并由 PLSCR3 外化到外線粒體膜 (OMM) 上 (圖 5 A)，為研究 GSDMD-NT 介導的線粒體損傷是否需要 OMM 心磷脂，作者對 iBMDMs 中對 CRLS1 和 PLSCR3 進行了基因敲除 (Cris1-/-和 Plscr3-/- iBMDMs)，并用 LPS 和 Nigericin 進行處理。

圖 5. OMM心磷脂是GSDMD介導的線粒體損傷所必需[1]。

(A) 心磷脂合成和易位示意圖。PG，磷脂酰甘油；CDP-DAG，二磷酸胞苷-二?；视?。(B) LPS或 LPS+Nigericin 處理的表達 mNG-GSDMD 的 WT、Plscr3^-/-或 Crlsr1^-/- iBMDM 的共聚焦活細胞成像，在添加 Nigericin 30 分鐘后進行 MitoTracker 深紅染色。白色箭頭表示 GSDMD 的線粒體募集。(C) 未處理或Nigerici n處理 30 分鐘后，LPS 預處理的 iBMDM 的全細胞裂解物 (WCL)、胞質(zhì) (細胞) 和線粒體 (mito)的免疫印跡。 (D) 通過 qPCR 檢測胞質(zhì) mtDNA。

研究發(fā)現(xiàn)， OMM 心磷脂介導了 GSDMD 依賴性的線粒體損傷。

• 在 LPS+Nigericin 處理的 Cris1-/- 和 Plscr3-/- iBMDMs 中，GSDMD-NT 沒有被招募到線粒體 (圖 5B)，而線粒體完整性和膜電位、線粒體數(shù)量和平均長度以及損害線粒體的百分比幾乎恢復到未處理的 WT iBMDMs 的狀態(tài) (圖中未顯示)。

• 此外，線粒體 ROS (圖中未顯示) 和 Cytochrome C 和 mtDNA 的胞質(zhì)釋放 (圖5C-D) 也被阻止。一致地，用 GSDMD 和 Caspase-11 處理的 Crls1-/- 和Plscr3-/- iBMDMs 的分離線粒體沒有釋放 Cytochrome C、HtrA2 或 mtDNA (圖中未顯示)。

同時，GSDMD 介導的線粒體損傷誘導 3’端- 5’端的核酸外切酶 PNPT1 釋放入胞質(zhì)，引發(fā)廣泛的 mRNA 降解以加重細胞焦亡發(fā)生、放大下游炎性反應(yīng)。也正是如此，提供了一個強大的正反饋機制來放大細胞死亡，被稱為“不歸路”。此外，該研究還揭示了線粒體損傷增強細胞焦亡誘導的機體抗腫瘤免疫應(yīng)答。

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參考文獻：
[1] Rui Miao, et al. Gasdermin D permeabilization of mitochondrial inner and outer membranes accelerates and enhances pyroptosis. Immunity. 2023 Nov 14;56(11):2523-2541.e8.
[2] Dominic P Del Re, et al. Fundamental Mechanisms of Regulated Cell Death and Implications for Heart Disease. Physiol Rev. 2019 Oct 1;99(4):1765-1817.
[3] Tessa Bergsbaken, et al. Pyroptosis: host cell death and inflammation. Nat Rev Microbiol. 2009 Feb;7(2):99-109.
[4] Xing Liu, et al. Inflammasome-activated gasdermin D causes pyroptosis by forming membrane pores. Nature. 2016 Jul 7;535(7610):153-8.
[5] Wei X,et al. Role of pyroptosis in inflammation and cancer. Cell Mol Immunol. 2022 Sep;19(9):971-992.
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[7] Aglietti RA,et al. GsdmD p30 elicited by caspase-11 during pyroptosis forms pores in membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Jul 12;113(28):7858-63.
[8] Evavold CL, et al. Control of gasdermin D oligomerization and pyroptosis by the Ragulator-Rag-mTORC1 pathway. Cell. 2021 Aug 19;184(17):4495-4511.e19.