介紹三種細(xì)胞凋亡試驗(yàn)方法

(一)藥物對腫瘤細(xì)胞的抑制效應(yīng)的MTT法:
用培養(yǎng)基將腫瘤細(xì)胞調(diào)整至2 X108個(gè)/L,在96孔板中每孔加入100ul細(xì)胞懸液于37℃、5% CO2下培養(yǎng)過夜.
次日每孔加入不同濃度的藥物100mg/L作為試驗(yàn)組,設(shè)加*培養(yǎng)基不加藥物的陰性對照,并用功能明確的藥物為陽性對照和0.5%的乙醇溶劑對照,每組均設(shè)4-6個(gè)復(fù)孔(平行孔)、37℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng).
培養(yǎng)至12h、24h、48h、實(shí)驗(yàn)終止前4-6h加入10ulMTT(5g/L),培養(yǎng)4-6h后,陰性對照孔中已形成明顯的藍(lán)紫色顆粒結(jié)晶時(shí)加100ul/孔SDS-HCl終止反應(yīng),于37℃存放過夜.
用酶標(biāo)儀在A570波長下測吸光度值,按下式計(jì)算抑制率
抑制率(%)=(1-試驗(yàn)組平均吸光度值/陰性對照組平均吸光度值) x 100%.

(二)熒光法:
選用上述*濃度作用于腫瘤細(xì)胞,培養(yǎng)細(xì)胞48h后,收貨細(xì)胞用PBS洗2-3次后用0.4%多聚甲醛室溫下固定30min.
棄去固定液,并用PBS洗2次后,用1%Triton X-100作用4min加入適量的0.5mg/L DAPI熒光染色60min,用PBS沖洗3次,取10ul滴片,干燥后于熒光顯微鏡下檢測斷裂的顆粒和片狀熒光.

(三)DNA瓊脂糖凝膠電泳法:
1、DNA提取:
用大方瓶培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞,每瓶10ml,細(xì)胞濃度為3 x 108個(gè)/ml,每隔藥物濃度、作用時(shí)間均設(shè)2瓶,共分3個(gè)時(shí)間段,4個(gè)藥物濃度.共培養(yǎng)26瓶細(xì)胞.
分別于細(xì)胞中加入不同濃度的藥物,于37℃、5% CO2中分別培養(yǎng)12h、24h、48h,收貨細(xì)胞,用PBS洗2-3次.
于-20℃將細(xì)胞冷卻處理10min后將細(xì)胞收集至離心管中,加1ml細(xì)胞裂解液,再加蛋白酶K,輕輕振搖使懸液混勻,成黏糊狀,50℃過夜.
冷卻后加入等體積的飽和酚溶液,混合后10000r/min離心10min,吸出上層水相,移至另一離心管中,再加入等體積飽和酚溶液重復(fù)抽提一次,直到無蛋白為止.
吸上清加入氯仿/異戊醇(24:1)按上述方法再抽提一次.
吸取水相層加入1/10體積的3mol/L的醋酸鈉溶液,混勻.
再加入2.5倍體積冷無水乙醇,混合置-20℃處理30min后,10000r/min離心10min,沉淀部分為提供的DNA,棄去無水乙醇后用70%乙醇漂洗2次,將離心管倒扣在吸水紙上,吸干乙醇.
加入200ulTE緩沖液融解DNA,再加入25ul的RNA酶,置37℃作用30min,置4℃冰箱保存.
2、瓊脂糖凝膠電泳:
TBE緩沖液配制1.8%瓊脂糖凝膠.在微波爐內(nèi)煮沸至瓊脂糖融解,待冷卻至60℃時(shí),加入溴化乙錠,使其終濃度為0.5mg/ml,混勻后灌膠.
待凝膠固定后放入含TBE電泳液的電泳槽內(nèi),使TBE電泳液蓋過凝膠.
取10-15ul提取的各組DNA樣品液與上樣緩沖液按4:1比例混勻后點(diǎn)樣.
60V電泳1h,用紫外透射儀觀察梯形條帶.