細(xì)胞骨架（肌動蛋白單體；G-ACTIN）紅色熒光染色試劑盒產(chǎn)品說明書

（中文版）

主要用途

  細(xì)胞骨架（肌動蛋白單體；G-ACTIN）紅色熒光染色試劑是一種旨在使用ALEXA染料標(biāo)記的DNA酶I，探尋細(xì)胞骨架的肌動蛋白單體的分布和局部定向變化狀況的典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。主要適用于各種活體細(xì)胞（動物、人體、植物等）的細(xì)胞骨架裝配的檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，反應(yīng)敏感，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

肌動蛋白（actin）是42KD的球蛋白，構(gòu)成細(xì)胞骨架的微絲（microfilament）和肌肉收縮裝置的細(xì)肌絲（thin filament），以及細(xì)胞膜表面?zhèn)巫悖?/span>pseudopodia）和微絨毛（microvilli）。肌動蛋白存在于所有真核生物細(xì)胞中，且高度進(jìn)化保留，參與各種重要細(xì)胞功能，包括細(xì)胞遷移、細(xì)胞分裂、肌肉收縮、細(xì)胞形態(tài)維護(hù)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)（membrane trafficking） 等。哺乳動物具有六種異構(gòu)體，分成α、β、γ三類。球狀肌動蛋白（G-actin）在生理?xiàng)l件下，組合成長絲聚合體，轉(zhuǎn)化為絲狀肌動蛋白（F-actin），形成細(xì)胞骨架的微絲。肌動蛋白的聚合與解聚的動態(tài)學(xué)變化是細(xì)胞骨架裝配（cytoskeleton assembly）的主要參數(shù)之一。牛胰腺DNA酶I（DNase I）具有與肌動蛋白單體（G-actin）高度親和力結(jié)合的特征，因此通過ALEXA染料標(biāo)記的DNA酶I可以體外探測細(xì)胞G-肌動蛋白的分布和含量，據(jù)此分析細(xì)胞骨架裝配的調(diào)控機(jī)制。

產(chǎn)品內(nèi)容

  清理液（Reagent A）               毫升

  固著液（Reagent B）             毫升

  通透液（Reagent C）             毫升

  染色液（Reagent D）           微升

  復(fù)染液（Reagent E）           微升

產(chǎn)品說明書             1份

保存方式

保存   染色液（Reagent D）和   復(fù)染液（Reagent E）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4℃冰箱里，避免光照；有效保證3月

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于細(xì)胞脫離

細(xì)胞培養(yǎng)液（GMS12052）：用于中和胰蛋白酶的處理

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于細(xì)胞染色的容器

（微型）臺式離心機(jī)：用于樣品操作

熒光（共聚焦）顯微鏡：用于細(xì)胞熒光觀察

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下凍融。移取xx微升   通透液（Reagent C）到1.5毫升離心管，然后分別加入xx微升   染色液（Reagent D）和   復(fù)染液（Reagent E），混勻后，標(biāo)記為   染色工作液，置于冰槽里，放進(jìn)暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作。

一、 直接法

1． 準(zhǔn)備1個細(xì)胞培養(yǎng)6孔板，內(nèi)置1個細(xì)胞1 X 1 cm大小的載玻片

2． 接種待測細(xì)胞培養(yǎng)，直至每孔鋪滿率達(dá)70％

3． 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液

4． 輕輕加上xx微升   清理液（Reagent A）到細(xì)胞載玻片上，覆蓋樣品表面

5． 小心抽去   清理液（Reagent A）

6． 輕輕加上xx微升   固著液（Reagent B）到細(xì)胞載玻片上，覆蓋樣品表面

7． 室溫下孵育15分鐘

8． 小心抽去   固著液（Reagent B）

9． 輕輕加上xx微升   通透液（Reagent C）到細(xì)胞載玻片上，覆蓋樣品表面

10． 室溫下孵育5分鐘

11． 小心抽去   通透液（Reagent C）

12． 輕輕加上xx微升   清理液（Reagent A）到細(xì)胞載玻片上，覆蓋樣品表面

13． 小心抽去   清理液（Reagent A）

14． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟12和13二次

15． 小心加上xx微升   染色工作液， 覆蓋樣品表面

16． 在暗室里室溫下孵育20分鐘

17． 小心抽去   染色工作液

18． 輕輕加上xx微升   清理液（Reagent A）到細(xì)胞載玻片上，覆蓋樣品表面

19． 小心抽去   清理液（Reagent A）

20． 封片

21． 即刻在熒光（共聚焦）顯微鏡下進(jìn)行觀察（每個視野計(jì)數(shù)200個細(xì)胞）：激發(fā)波長590nm，散發(fā)波長617nm（G-肌動蛋白染色）或激發(fā)波長350nm，散發(fā)波長460nm（細(xì)胞核染色）――

紅色熒光顯示G-肌動蛋白；藍(lán)色熒光顯示細(xì)胞核為圓環(huán)或橢圓狀

二、 間接法

1． 準(zhǔn)備1個25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的待測細(xì)胞，直至鋪滿率達(dá)70％（約100萬細(xì)胞數(shù)）

2． 小心移出細(xì)胞培養(yǎng)液到15毫升錐形離心管（收集懸浮細(xì)胞）

3． 加入xx毫升   清理液（Reagent A），覆蓋細(xì)胞表面

4． 小心移出xx毫升   清理液（Reagent A）到15毫升錐形離心管

5． 加入1毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿細(xì)胞表面

6． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育1分種

7． 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落

8． 加入3毫升用戶自備的細(xì)胞培養(yǎng)液

9． 移入到15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞可以由此步開始）

10． 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

11． 小心抽去上清液

12． 加入xx微升   清理液（Reagent A），混勻

13． 轉(zhuǎn)入到1.5毫升離心管

14． 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）

15． 小心抽去上清液

16． 加入xx微升   固著液（Reagent B），混勻

17． 室溫下孵育15分鐘

18． 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）

19． 小心抽去上清液

20． 加入xx微升   通透液（Reagent C），混勻

21． 室溫下孵育5分鐘

22． 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）

23． 小心抽去上清液

24． 加入xx微升   清理液（Reagent A），混勻

25． 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）

26． 小心抽去上清液

27． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟24至26二次

28． 加入xx微升   染色工作液

29． 用200微升槍頭上下輕柔抽吸，混勻細(xì)胞顆粒群

30． 在暗室里室溫下孵育20分鐘

31． 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）

32． 小心抽去上清液

33． 加入xx微升   清理液（Reagent A），混勻

34． 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）

35． 小心抽去上清液

36． 加入xx微升   清理液（Reagent A），混勻

37． 即刻移取10微升在載玻片上壓片

38． 在熒光（共聚焦）顯微鏡下進(jìn)行觀察（每個視野計(jì)數(shù)200個細(xì)胞）：激發(fā)波長590nm，散發(fā)波長617nm（G-肌動蛋白染色）或激發(fā)波長350nm，散發(fā)波長460nm（細(xì)胞核染色）――

紅色熒光顯示G-肌動蛋白；藍(lán)色熒光顯示細(xì)胞核為圓環(huán)或橢圓狀

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為10次操作

2． 在整個操作過程中須戴手套，以防污染

3． 孵育時，必須避免光照

4． 建議檢測細(xì)胞量達(dá)10⁶細(xì)胞數(shù)為佳

5． 用戶可以根據(jù)情況，適度調(diào)整試劑用量

6． 建議細(xì)胞染色完成后，即刻進(jìn)行熒光分析，不宜超過1小時

7． 本公司提供系列細(xì)胞骨架檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰