支原體檢查培養(yǎng)基基本知識：
支原體(Mycoplasma)是細胞培養(yǎng)過程中常見的外源性污染物，開展支原體污染檢測是細胞質(zhì)量控制微生物學(xué)安全性評價體系中的一項重要內(nèi)容。由于活細胞制劑終產(chǎn)品不能滅菌處理，被支原體污染后不像細菌或者真菌那樣容易被肉眼看見，所以在其培養(yǎng)時也很難被觀察。因此需要適宜的支原體檢測方法。目前，《中華人民共和國藥典》規(guī)定的支原體檢測方法培養(yǎng)法和指示細胞培養(yǎng)法 (DNA染色法)是檢測支原體的“金標準”，能夠檢測不同生長特性的支原體，具有廣譜性 。

環(huán)凱的精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基（貨號：MP01B/MP01BP）和精氨酸支原體半流體培養(yǎng)基（貨號：MP01S/MP01SP）可用于檢驗利用精氨酸的支原體，如口腔支原體等，支原體肉湯培養(yǎng)基（貨號：MP02B/MP02BP）和支原體半流體培養(yǎng)基（貨號：MP02S/MP02SP）可用于檢驗利用葡萄糖的支原體，如肺炎支原體等。

支原體檢測培養(yǎng)基原理：

精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基：利用口腔支原體分解利用精氨酸產(chǎn)堿使得原本含酚紅的橙色培養(yǎng)基變?yōu)榧t色。精氨酸支原體半流體培養(yǎng)基：直接培養(yǎng)口腔支原體于營養(yǎng)物質(zhì)充足的培養(yǎng)基中，觀察其生長及菌落生成。支原體肉湯培養(yǎng)基：肺炎支原體通過葡萄糖代謝路徑利用葡萄糖產(chǎn)酸致使原本含酚紅的橙色培養(yǎng)基變?yōu)榈S色。支原體半流體培養(yǎng)基：直接培養(yǎng)肺炎支原體接種于營養(yǎng)物質(zhì)充足的培養(yǎng)基中，觀察其生長及菌落生成。

方法來源：

《中國藥典》2020年版 3301 支原體檢查法

靈敏度檢查（變色單位試驗法）

器具：

→試管：螺口旋蓋試管，利于培養(yǎng)時保持密閉；或者普通玻璃試管，滅菌時使用硅膠塞，培養(yǎng)時換成橡膠塞；或者培養(yǎng)時使用無菌液體石蠟液封。
→新生牛血清或者馬血清
→生物安全柜、生化培養(yǎng)箱等。
→培養(yǎng)基配制：
→基礎(chǔ)培養(yǎng)基：按標簽所示配制方法制備，分裝8 mL/支，121℃滅菌15 min，待用。
→完quan培養(yǎng)基：臨用前每支8 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入2 mL新生牛血清或馬血清。

※ 半流體培養(yǎng)基在使用前應(yīng)煮沸5~10 min，冷卻至55℃左右，然后加入新生牛血清或馬血清，充分搖勻。

→接種及培養(yǎng)：選取變色的新鮮培養(yǎng)物，接種至待檢培養(yǎng)基中，做10倍系列稀釋，肺炎支原體稀釋至 10??~10??，接種在支原體肉湯/半流體培養(yǎng)基內(nèi)；口腔支原體稀釋至 10?3~10??，接種在精氨酸支原體肉湯/半流體培養(yǎng)基內(nèi)。每個稀釋度接種3 支試管，置36±1℃密閉培養(yǎng)7?14天，觀察培養(yǎng)基變色結(jié)果。

→結(jié)果判定：以接種后培養(yǎng)基管數(shù)的 2/3 以上呈現(xiàn)變色的最高稀釋度為該培養(yǎng)基的靈敏度。

→陽性案例展示 

   圖A：精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)結(jié)果，左邊紅色為陽性右邊橙色為陰性；

   圖B：精氨酸支原體半流體培養(yǎng)結(jié)果，左邊有菌落懸浮為陽性，右邊試管為陰性；
   圖C：支原體肉湯培養(yǎng)結(jié)果，左邊黃色為陽性，右邊橙色為陰性；

   圖D：支原體半流體培養(yǎng)結(jié)果，左邊有菌落懸浮為陽性，右邊試管為陰性。

注意事項

→靈敏度測定時，支原體活化和傳代時建議做陰性對照，肉眼觀察到明顯的顏色變化時，需盡快進行傳代，過度培養(yǎng)會導(dǎo)致支原體的活性明顯衰減；

→半流體培養(yǎng)基煮沸融化時以全部溶解為宜，過度加熱易導(dǎo)致營養(yǎng)損失，接種時盡量在培養(yǎng)基未凝固，溫度約為37℃時接種支原體；

→支原體凍存可以使用10%甘油，凍干保護劑推薦選擇6%的蔗糖與1.5%的明膠。