熒光原位雜交（FISH）探針的制備

實(shí)驗(yàn)原理

染色體熒光原位雜交始于傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)和DNA技術(shù)的結(jié)合，這種結(jié)合開(kāi)創(chuàng)了一門(mén)新的學(xué)科——分子細(xì)胞遺傳學(xué)。其基礎(chǔ)是Southern blot原理，以半抗原如生物素標(biāo)記或以熒光素直接標(biāo)記的已知核酸分子為探針，探針和靶序列雙鏈DNA變性后雜交，互補(bǔ)的異源單鏈DNA分子在適宜的溫度和離子強(qiáng)度下退火形成穩(wěn)定的異源雙鏈DNA，通過(guò)熒光標(biāo)記的親和素將半抗原顯示出來(lái)，通過(guò)熒光顯微鏡觀察雜交信號(hào)。FISH具有快速靈敏、特異性好的特點(diǎn)，可同時(shí)分析分裂期和間期的多個(gè)細(xì)胞，并進(jìn)行定量；可以檢測(cè)隱匿或微小的染色體畸變以及復(fù)雜核型；還可以使用多種熒光標(biāo)記，顯示DNA片段及基因之間的相對(duì)位置與方向，空間定位精確。

實(shí)驗(yàn)步驟

第一天

缺口平移標(biāo)記探針

1. 試劑準(zhǔn)備

   1） 0.1mmol/L dNTP

0.3mmol/L dATP、0.3mmol/L dCTP和0.3mmol/L dGTP等體積混合。

   2） 0.1mmol/L dTTP

1倍體積的0.3mmol/L dTTP和2倍體積的三蒸水混合。

2. 缺口平移體系和反應(yīng)條件

0.1mmol/L dTTP 6.5μl

0.1mmol/L dNTP 10μl

10× Nick Translation buffer 5μl

1mmol/L DIG-11-dUTP /Biotin-16-dUTP 0.5μl

Nick Translation Enzyme 10μl

DNA (1μg) X μl

H₂O 18-X μl

in total 50μl

以上為標(biāo)記1μg DNA的缺口平移體系，若標(biāo)記更多量的DNA，則試劑量和反應(yīng)體系相應(yīng)等倍擴(kuò)大。各成分混勻后短時(shí)離心。對(duì)于≤10kb的質(zhì)粒，于15℃反應(yīng)3.5小時(shí)；對(duì)于BAC/PAC，于15℃反應(yīng)9小時(shí)。

3. 凝膠電泳判斷探針大小

將EP管置于冰上，取其中5μl 于70℃加熱5分鐘后行2 ％瓊脂糖凝膠電泳以觀察所標(biāo)記探針的大小，單一序列探針合適大小為200～600bp；如片段大小偏大，則于15℃延長(zhǎng)反應(yīng)10～30分鐘，再重復(fù)進(jìn)行凝膠電泳，直至得到合適大小的探針。

4. 終止反應(yīng)

向反應(yīng)體系中加入1μl 0.5M EDTA和（或）70℃加熱5分鐘，以滅活酶。探針于-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>

第二天

1. 探針的沉淀和變性

   1) 探針混合物的組成

      a. 對(duì)BAC/PAC探針

DNA探針 5ul

Human Cot-1 DNA 3ul

Salmon Sperm DNA 0.5ul

H₂O 1.5ul

in total 10ul

      b. 對(duì)著絲粒探針：

DNA探針 5ul

Salmon Sperm DNA 0.5ul

H₂O 4.5ul

in total 10ul

   2) DNA的沉淀

將探針混合物與1ul（V/10）3M醋酸鈉（PH5.2）和27.5ul（2.5V）無(wú)水乙醇（-20℃凍存）混合，-80℃沉淀30min（或-20℃沉淀過(guò)夜），以14000g在4℃離心30min，以沉淀DNA。

   3) 清洗沉淀

小心棄去上清，用70 ％乙醇洗滌一次，再次以14000g在4℃離心15min；小心棄去上清，在45～50℃的中溫水浴中風(fēng)干DNA沉淀10～15min。

注：當(dāng)大部分乙醇蒸發(fā)時(shí)，白色的DNA沉淀變?yōu)榘胪该鳡睿粍?wù)必清除乙醇，否則會(huì)在加入Master Mix后產(chǎn)生微小的沉淀，導(dǎo)致高背景。

   4) 溶解探針

加入5μl 預(yù)熱至37℃的去離子甲酰胺（PH 7.0），短時(shí)離心后在37℃振搖30min以充分溶解DNA；再加入預(yù)熱至37℃的Master Mix 5μl，短時(shí)離心后在37℃振搖15～30min。

注：振搖時(shí)間盡可能延長(zhǎng)；DNA沉淀亦可以TE緩沖液1.1μl溶解后加入Vysis探針緩沖液4.4μl稀釋?zhuān)靹蚝笏矔r(shí)離心，37℃振搖15～30min。

   5) 探針的變性和預(yù)雜交

短時(shí)離心后于80℃水浴中變性探針10min，冰浴5分鐘；短時(shí)離心，于37℃水浴中預(yù)雜交30～60min；序列探針（如cDNA）和重復(fù)序列探針（如α-衛(wèi)星DNA）探針，無(wú)需預(yù)雜交。

2. 標(biāo)本（染色體靶DNA）的處理和變性

   1) 滴片和老化

取出儲(chǔ)存于-20℃的細(xì)胞懸液標(biāo)本，以1100 rpm.離心10min沉淀細(xì)胞，換用適量體積的新鮮甲醇:冰乙醇（v/v）＝3:1固定液重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度，滴片，劃出雜交區(qū)域，晾干；在預(yù)熱到 37℃的2×SSC中老化30min（也可實(shí)驗(yàn)前夜室溫過(guò)夜老化再以2×SSC浸泡2分鐘）；依次于70 %、90 %和100 %的梯度乙醇中依次脫水，每缸2min，晾干（以下略作“梯度乙醇脫水后涼干”）。

   2) RNase A消化

每張玻片上加30μl 100μg/ml RNA酶（將10mg/ml的RNase A儲(chǔ)存液稀釋100倍），蓋上22×22mm蓋玻片，置于37℃濕盒中孵育1小時(shí)；室溫下2×SSC中振蕩洗滌，5min/次×3次；梯度乙醇脫水后涼干。

   3) 靶DNA的變性

將玻片放入預(yù)溫至72℃（每增加一張玻片，溫度要提高1℃）的70 %去離子甲酰胺/2×SSC中變性2分鐘后，立即置入預(yù)冷至-20℃保存的梯度乙醇脫水晾干。

   4) 蛋白酶消化

將50μl 100 mg/ml的胃蛋白酶（終濃度為0.01 ％）加入預(yù)溫至37℃的50ml蒸餾水（PH 2.0，以適量稀鹽酸酸化）中，混勻；將變性后的玻片放入其中處理10分鐘；室溫下1×PBS中振蕩洗滌，5min/次×2次；室溫下梯度乙醇脫水后涼干。

注：靶DNA的變性和消化應(yīng)與探針變性同步進(jìn)行，完成后盡快進(jìn)行雜交。

3. 雜交

將變性后的DNA探針加于玻片雜交區(qū)域，蓋上22mm×22mm蓋玻片，封片后置于濕盒中，37℃雜交過(guò)夜。

第三天

1. 雜交后洗滌和半抗原信號(hào)放大

   1) 雜交后洗片

小心揭去封片膠和蓋玻片，將玻片置于預(yù)熱至46℃的50 ％甲酰胺/2×SSC中，5min×3缸；將玻片移入室溫下4×SSC/0.1 % Tween-20中振蕩洗滌5min×2缸；每張玻片滴加30 μl阻斷液1，蓋上22mm×22mm蓋玻片，于37℃濕盒中孵育30min；再次將玻片移入室溫下4×SSC/0.1 % Tween-20中振蕩洗滌5min×2缸。

注：此后步驟應(yīng)注意避光操作。

   2) 滴加一抗

將4 μl Anti-DIG monoclonal antibody 和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀釋于100 μl 抗體稀釋液1中，混勻；每張玻片滴加25 μl 于雜交區(qū)域，蓋上22mm×22mm蓋玻片，于37℃濕盒中孵育1小時(shí)；室溫下4×SSC/0.1 % Tween-20中振蕩洗滌5min×2缸。

   3) 滴加二抗

將4 μl Anti-mouse-Ig-DIG 和1 μl Biotinylated goat anti-Avidin 稀釋于100 μl 抗體稀釋液1中，混勻；每張玻片滴加25 μl 于雜交區(qū)域，蓋上22mm×22mm蓋玻片，于37℃濕盒中孵育40min；室溫下4×SSC/0.1 % Tween-20中振蕩洗滌5min×2缸。

   4) 滴加三抗

將4 μl Anti-DIG-Fluorescein和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀釋于100 μl 抗體稀釋液1中，混勻；每張玻片滴加25 μl 于雜交區(qū)域，蓋上22mm×22mm蓋玻片，于37℃濕盒中孵育30min；室溫下4×SSC/0.1 % Tween-20中振蕩洗滌5min×2缸。

注：以上步驟按雙色FISH描述，若為單色FISH則選擇相應(yīng)抗體即可。

2. 核復(fù)染和抗熒光淬滅劑封片

將1.25 μl 5 mg/ml的DAPI加入50 ml 2×SSC中（終濃度為125 ng/ml，避光保存于4℃），混勻；將玻片置于其中，避光復(fù)染2min；2×SSC中洗滌5min；梯度乙醇脫水晾干；每張玻片滴加10 μl 抗熒光淬滅劑封片，蓋上22mm×22mm蓋玻片，-20℃避光保存。

3. 熒光顯微鏡檢測(cè)FISH雜交信號(hào)

以熒光顯微鏡觀察，在DAPI/FITC/Texas Red濾光鏡激發(fā)下觀察中期/間期細(xì)胞的熒光雜交信號(hào)，計(jì)數(shù)細(xì)胞和采集圖像。每例分析100～200個(gè)間期細(xì)胞核細(xì)胞，重疊、破損、未去除細(xì)胞質(zhì)和雜交信號(hào)微弱的細(xì)胞核不計(jì)入其中。對(duì)于雙色雙融合FISH，細(xì)胞內(nèi)雜交信號(hào)相互靠近（<1/10核直徑的距離）者計(jì)為一個(gè)信號(hào)。

4. 儲(chǔ)存數(shù)據(jù)