基于RTI（上圖）與SSI（下圖）的細胞系開發(fā)過程圖示^[1]

在基于RTI的細胞系開發(fā)過程中，攜帶轉(zhuǎn)基因遺傳信息和選擇標(biāo)記的線性化質(zhì)粒穩(wěn)定地整合到CHO宿主細胞的基因組中。因此，具有不可預(yù)測結(jié)構(gòu)的多拷貝轉(zhuǎn)基因整合將發(fā)生在未知基因組位點上，代謝選擇后產(chǎn)生的細胞庫顯示出高水平的基因組和表型多樣性。對于基于SSI的CLD，能夠在基因組的特定位點精確插入或整合外源DNA片段，從而實現(xiàn)對特定基因的添加、刪除或替換，可使得細胞庫顯示出較低的表型異質(zhì)性。相比于RTI，SSI具有高整合效率、外源基因可實現(xiàn)精確定位、基因表達具有一致性、減少位置效應(yīng)使得基因表達受控、提高細胞株的安全性及簡化篩選流程等優(yōu)勢。

BxB1整合酶定點整合外源基因

FLP/FRT重組酶定點整合外源基因圖示

Cre/Lox重組酶定點整合外源基因圖示

目前，已有一些制藥企業(yè)（武田制藥、羅氏、強生等）利用智能定點整合技術(shù)優(yōu)化其生物藥物的生產(chǎn)流程，包括開發(fā)穩(wěn)定細胞株用于大規(guī)模生產(chǎn)。而利用整合酶定點整合外源基因的方式對于國內(nèi)制藥企業(yè)來說目前還是處于萌芽階段。但定點整合技術(shù)對抗體藥物開發(fā)帶來的前景是可預(yù)期的，眾多生物制藥企業(yè)一直期盼能盡快將定點整合應(yīng)用于自身平臺中，加速細胞株的開發(fā)。

通過定點整合技術(shù)，將目標(biāo)基因序列通過同源重組的方式轉(zhuǎn)染到已經(jīng)通過前期篩選驗證過的活躍位點當(dāng)中，構(gòu)建均一細胞池。其首先需要構(gòu)建平臺細胞，利用報告基因（如GFP 等） 篩選得到宿主細胞基因組中的高表達位點，之后利用重組酶的特異性，實現(xiàn)將目標(biāo)產(chǎn)品基因插入在該表達量高、質(zhì)量和表達量穩(wěn)定的宿主細胞基因組位點，再利用Cytena克隆篩選單細胞打印系統(tǒng)，獲得穩(wěn)定及高產(chǎn)的單克隆細胞株。

定點整合單克隆篩選流程

細胞類型：CHO-K1

細胞狀態(tài)：35%陽性率；80%活率

單細胞挑選設(shè)備：Cytena克隆篩選單細胞打印系統(tǒng)，對照組：FACS

單細胞、單克隆率：

通過無熒光轉(zhuǎn)化子同源同組，細胞樣品內(nèi)有帶有熒光的母細胞也有無熒光即轉(zhuǎn)化子同組成功的目的細胞，12天后采用Cytena克隆篩選單細胞打印系統(tǒng)進行無熒光細胞鋪板（只分選非熒光的細胞），單細率約為85%，克隆恢復(fù)率約為20%，而對照組流式由于分選過程對單細胞狀態(tài)及活力造成損傷，后續(xù)單細胞難以恢復(fù)成克隆。此流程可以省去minipool與有限稀釋的環(huán)節(jié)，加快開發(fā)流程，值得一提的是，用定點整合方式，經(jīng)單細胞打印系統(tǒng)分選獲得的單克隆，后續(xù)產(chǎn)量＞5g/L，約為隨機整合表達量的1.5-2倍，此流程可降低開發(fā)時間和成本，提升開發(fā)效能，大大縮短整個工藝開發(fā)及IND申報時間。

智能定點整合技術(shù)在單克隆細胞株篩選中具有高效、精確和安全等顯著優(yōu)勢，當(dāng)然其也面臨技術(shù)復(fù)雜、成本高以及潛在脫靶效應(yīng)等挑戰(zhàn)，選擇使用SSI技術(shù)需綜合考慮實驗?zāi)康?、成本和技術(shù)能力等因素。