使用原子力顯微鏡可以很容易的研究細(xì)胞表面的形貌以及力學(xué)性質(zhì)，在2019年發(fā)表于Nanoscale的文章中Nanoscale, 2019,11, 10320-10328, ）里爾巴斯德研究所的Frank Lafont等將布魯克NanoWizard Ultra Speed生物型原子力顯微鏡與STED超分辨熒光顯微鏡相結(jié)合，在納米尺度上對細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器和微生物進(jìn)行了表征。作者分別對感染了假結(jié)核病桿菌（Yersinia pseudotuberculosis）的固定PtK2細(xì)胞和活細(xì)胞中的線粒體進(jìn)行了測試。

作者使用彈性系數(shù)大約0.09N/m、曲率半徑大約8nm的AC40探針測試細(xì)胞樣品的模量和硬度，利用BioAFM的SPM軟件進(jìn)行Sader法校準(zhǔn)（Contact-free）探針。在使用QI模式進(jìn)行掃描時，作用力被設(shè)定為不損壞細(xì)胞的情況下的*值。對于固定細(xì)胞作用力大約3 nN，活細(xì)胞大約1 nN。通過明場顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)和QI模式中力曲線是否發(fā)生破裂（rupture event）即可判斷細(xì)胞是否受損。得益于NanoWizard UltraSpeed原子力顯微鏡的高速性能，探針在Z方向的速度（Z speed）達(dá)到了300 μm/s，Z方向距離（Z range）為2 μm，力曲線的噪聲控制在19-24 pN。

圖1  (a) 使用Sneddon模型擬合壓入曲線（黑色），計算自接觸點（POC）處的表觀楊氏模量（綠色）；(b) 由于檢測到的細(xì)胞內(nèi)部模量不同而導(dǎo)致的力-距離曲線的扭曲，形成不同剛度的片段（從藍(lán)色：軟 到 紅色：硬）。

細(xì)胞的彈性模量使用Sneddon模型擬合下壓力曲線（Approach FD curve）得到。樣品的型變量δ與接觸力F、樣品的楊氏模量E、泊松比ν和探針*的半角α都有關(guān)系。雖然AC40的針尖形狀既不是純球形也不是圓錐形，但在較大壓入深度下，可以看作是圓錐形。（圖1 a）

然而，當(dāng)在細(xì)胞上使用相對小的壓頭進(jìn)行大壓入深度實驗時，F(xiàn)D力曲線顯示出非線性和不均勻性（圖1b），這對應(yīng)于細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)剛度的差異。這時使用傳統(tǒng)的Hertz/Sneddon模型不能恰當(dāng)?shù)孛枋鰯?shù)據(jù)。如果分段擬合下壓曲線的斜率，就可以獲得每一段的剛度數(shù)值：

ΔSi = ΔFi/Δδi,

其中Si是剛度，F(xiàn)i是力，δi是段i的壓入深度。作者使用自自行開發(fā)的軟件（pyAF，Python原子力）進(jìn)行的數(shù)據(jù)處理就可以得到剛度斷層數(shù)據(jù)。

(a) 細(xì)胞表面形貌圖（作用力為零，平面擬合）。(b) 細(xì)胞表面受作用力后的形貌圖（3 nN，平面擬合）。(c) 在每個點擬合FD力曲線計算的表觀彈性模量圖。(d) 不同壓入深度下的剛度斷層圖：左側(cè)：[0–50] nm，右側(cè)：[200–250] nm。(e) 對應(yīng)于不同細(xì)胞內(nèi)區(qū)域的表觀彈性模量。(f) 結(jié)合STED超分辨率顯微鏡識別細(xì)胞區(qū)域。左：DAPI，中：LC3，右：肌動蛋白。(g) 結(jié)合透射電子顯微鏡獲得的超微結(jié)構(gòu)（2張切片）。白色箭頭：肌動蛋白；紅色虛線：細(xì)菌；白色環(huán)：線粒體。比例尺：白色：2 μm，黑色：500 nm。

為了測試細(xì)胞內(nèi)微生物的模量，作者對感染了假結(jié)核病桿菌（Yersinia pseudotuberculosis）的固定PtK2細(xì)胞進(jìn)行了原子力顯微鏡（AFM）實驗。細(xì)胞被感染后固定，并標(biāo)記了肌動蛋白細(xì)胞骨架、細(xì)菌和LC3陽性的自噬泡。通過明場顯微鏡、熒光顯微鏡、AFM以及電子顯微鏡依次對單個細(xì)胞進(jìn)行成像（圖2a、f和g）。圖2a顯示了細(xì)胞在探針作用力為零時的圖像。此時細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域不可見，但我們可以觀察到固定對膜孔的影響。圖2b顯示了在*壓入深度時細(xì)胞的高度圖。樣品內(nèi)的不同硬度導(dǎo)致了相同施加力的不同*壓入深度。一些結(jié)構(gòu)（可能對應(yīng)于細(xì)菌、線粒體和肌動蛋白細(xì)胞骨架）變得清晰可見。經(jīng)熒光和電子顯微鏡可以確認(rèn)細(xì)菌（紅色虛線）的位置（圖2f和g）。細(xì)菌用DAPI和LC3標(biāo)記，表明細(xì)菌位于自噬泡中（圖2f左和中）。AFM和熒光觀察還可以獲得有關(guān)肌動蛋白細(xì)胞骨架的相關(guān)性。*，線粒體通過電子顯微鏡觀察到（圖2g）。通過表觀彈性模量圖（圖2c）可以看出來肌動蛋白池和細(xì)菌的似乎比線粒體更硬。通過對不同感興趣區(qū)域的彈性模量進(jìn)行量化可以證實這一點（圖2e）。對同一數(shù)據(jù)上在兩個壓入深度[0–50] nm和[200–250] nm上執(zhí)行了剛度斷層掃描（圖2d）后，可以發(fā)現(xiàn)在低壓入深度時，可以識別出3個肌動蛋白束。在更大的壓入深度時，這些束消失了。這表明它們位于細(xì)胞頂部，而AFM在細(xì)胞更深處探測到了幾個線粒體。

(a) 顯示了活體PtK2細(xì)胞內(nèi)線粒體的大尺度熒光圖像，白色方框突出顯示了AFM掃描區(qū)域；(b) 以1 nN作用力進(jìn)行掃描的線粒體的時間序列熒光圖像；(c) 以3 nN觸發(fā)力進(jìn)行掃描的線粒體的時間序列熒光圖像。比例尺：1 μm，白色方框：AFM掃描區(qū)域；白色圓盤：AFM探針位置；黑色環(huán)：原始線粒體形狀；黑色箭頭：融合位點；白色箭頭：分裂位點。

作者隨后在37°C的HEPES緩沖介質(zhì)中對活細(xì)胞進(jìn)行了壓入實驗。如圖3b所示，普通大小的作用力并不會產(chǎn)生線粒體的形態(tài)學(xué)變化。然后，作者通過施加更高的觸發(fā)力（圖3c）能夠移動、融合甚至分裂一些線粒體。選擇適當(dāng)?shù)牧τ糜诨罴?xì)胞剛度測量非常重要。實際的作用力將取決于細(xì)胞類型以及針尖的幾何形狀，因為更尖銳的針尖將對細(xì)胞產(chǎn)生更大的局部影響。實驗中作用力設(shè)置為1 nN，對應(yīng)于平均壓入深度為400 nm。

(a) CCCP處理前后活體PtK2細(xì)胞內(nèi)線粒體的熒光圖像，0分鐘（頂部）和30分鐘（底部）（比例尺5 μm）；(b) 1 nN下的AFM測得形貌；(c) 實驗中的樣品下壓FD力曲線。頂部：均勻彈性材料；中部和底部：由于遇到硬細(xì)胞器而產(chǎn)生的兩個不連續(xù)的示例；(d) CCCP處理細(xì)胞在[50–100] nm壓入深度處的剛度圖（比例尺2 μm）（左）隨時間變化的線粒體區(qū)域（白色虛線）的對應(yīng)剛度值（右）；(e) 對照組活體PtK2細(xì)胞內(nèi)線粒體的熒光圖像（比例尺5 μm）（左），對照組細(xì)胞在[60–120] nm壓入深度處的剛度圖（比例尺2 μm）（中），隨時間變化線粒體區(qū)域（白色虛線）的對應(yīng)剛度值（右）。

接下來作者使用控制藥物CCCP來干擾線粒體生理學(xué)，該藥物可以解偶線粒體氧化磷酸化并主要作為質(zhì)子載體，降低ATP合酶的功能。同時使用光學(xué)顯微鏡和原子力顯微鏡（圖4a和b）能夠?qū)崟r跟蹤藥物對線粒體伸長結(jié)構(gòu)的破壞作用，*終導(dǎo)致線粒體碎裂。實驗開始時，大多數(shù)線粒體呈纖維狀。在暴露于藥物5分鐘后，已經(jīng)能夠檢測到線粒體管狀網(wǎng)絡(luò)的紊亂（圖4a和b）。通過力曲線（圖4c）可以觀察到細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)硬度的增加（圖4d）。結(jié)合光學(xué)顯微鏡，能夠確認(rèn)這些結(jié)構(gòu)與線粒體碎片有關(guān)。在對照組中，未經(jīng)處理的細(xì)胞中沒有測量到這種劇烈的硬度變化（圖4e）。

在本文中，作者展示了觀察和感知細(xì)胞內(nèi)膜組分的可能性。使用布魯克BioAFM型原子力顯微鏡可以與各種光學(xué)顯微鏡相結(jié)合精確定位細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器和微生物并了解它們的機(jī)械性質(zhì)。剛度斷層成像利用力曲線獲得的剛度的對比度，無需特定的樣品處理或染色即可定位細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)，它提供了到目前為止通過其他技術(shù)無法獲得的納米尺度上的機(jī)械信息。光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡為機(jī)械性能提供了寶貴且互補(bǔ)的信息。前者可以實時識別細(xì)胞組分，而后者允許對樣品進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)分析。