維生素B12在造血和髓鞘形成中的關鍵作用，其缺乏可能導致的神經(jīng)功能障礙，包括失調和認知能力下降。然而，維生素B12缺乏的診斷依賴于血液中的測量，這可能無法準確反映大腦中的濃度。為了解決這一問題，來自UCSF的John V. Pluvinage等人領導的研究團隊在Science Translational Medicine上發(fā)表了他們的研究成果，通過使用可編程噬菌體展示和Beacon單細胞光導等先進技術，識別了一種新的自身抗體，這種抗體靶向轉鈷胺素受體（CD320），并發(fā)現(xiàn)它能夠干擾B12在體外的細胞攝取。此外，他們還通過全基因組CRISPR篩選發(fā)現(xiàn)了低密度脂蛋白受體（LDLR）作為B12在造血細胞中的替代攝取途徑，為理解和治療相關的自身免疫性和神經(jīng)退行性疾病提供了新的見解。

研究亮點

?新病癥的發(fā)現(xiàn)與診斷：研究揭示了自身免疫性維生素B12中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺乏癥（ABCD），并發(fā)現(xiàn)anti-CD320自身抗體作為診斷這一病癥的潛在標志物，這可能改變傳統(tǒng)的維生素B12缺乏診斷方法。

?Beacon®技術在自身抗體發(fā)現(xiàn)中的應用：利用Beacon®單細胞光導系統(tǒng)，研究者從患者血液中成功鑒定并分離出針對CD320的單克隆自身抗體，這一技術的應用為發(fā)現(xiàn)和研究自身免疫性疾病中的特定自身抗體提供了新的途徑。

?治療方法的探索：研究提出了針對ABCD的治療策略，包括免疫抑制治療和高劑量維生素B12補充，這為治療相關的神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了新的視角和潛在的臨床干預手段。

?維生素B12轉運機制的深入理解：通過全基因組CRISPRi篩選，研究揭示了LDLR作為造血細胞中維生素B12的替代攝取途徑，增進了對維生素B12在不同組織中轉運機制的理解，并可能對相關疾病的治療產生影響。

主要研究結果

PhIP-seq發(fā)現(xiàn)患者體內

轉鈷胺素受體（CD320）自身抗體

研究團隊通過可編程噬菌體展示技術（PhIP-seq）在一個患有進行性神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的患者的腦脊液中發(fā)現(xiàn)存在一種新的自身抗體。這種自身抗體靶向的是轉鈷胺素受體（CD320），CD320這是一種在細胞攝取維生素B12中發(fā)揮關鍵作用的受體。研究人員發(fā)現(xiàn)，這種anti-CD320自身抗體能夠通過消耗細胞表面的CD320受體，損害細胞對全轉鈷胺素的攝取，這一過程在體外實驗中得到了證實。即使患者血清中的維生素B12水平正常，其腦脊液中的B12水平卻異常低。高劑量的維生素B12補充治療能夠提高患者腦脊液中的B12水平，并帶來臨床癥狀的改善。

這些發(fā)現(xiàn)揭示了一種新的自身免疫機制，即通過anti-CD320自身抗體干擾維生素B12在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的運輸，可能導致特定的神經(jīng)功能缺損。

圖1.發(fā)現(xiàn)并驗證功能性轉鈷胺素受體自身抗體

利用Beacon®從患者PBMC中鑒定出

單克隆自身抗體序列

研究者利用Beacon®單細胞光導系統(tǒng)從患者的外周血單個核細胞（PBMCs）中分離并鑒定出了分泌anti-CD320的單克隆B細胞。具體來說，研究者使用Beacon®分析了數(shù)萬個單個B細胞，以尋找針對CD320的特異性抗體分泌細胞。通過熒光標記的CD320肽四聚體，研究者能夠識別并特定的B細胞克隆。在分離得到的五個抗體分泌B細胞中攜帶有相同的B細胞受體可變序列，表明它們通過克隆擴增而來。

通過這種方法，研究者不僅成功地識別和測序了這些特定的B細胞，而且還能夠表達出患者來源的anti-CD320單克隆抗體，在細胞基礎上確認了這種單克隆抗體能夠與全長CD320結合，并且能夠通過BLI技術檢測到其與CD320肽的結合，并在體外模型中驗證了這些抗體對B12運輸?shù)囊种谱饔?。這些發(fā)現(xiàn)為理解某些神經(jīng)癥狀與維生素B12運輸障礙之間的聯(lián)系提供了新的視角，并可能有助于開發(fā)針對這類自身免疫性疾病的新療法。

圖2. 從患者體內分離出單克隆自身抗體

全基因組CRISPRi發(fā)現(xiàn)B12攝取的替代途徑

研究究者通過全基因組CRISPR干擾（CRISPRi）篩選，探索了在存在抗-CD320自身抗體的情況下，血液細胞如何補償系統(tǒng)性的CD320功能損害，并維持維生素B12的攝取。利用K562細胞系，研究者篩選了大約200,000個針對所有編碼基因的sgRNAs，發(fā)現(xiàn)低密度脂蛋白受體（LDLR）是除了CD320之外的另一個重要的B12攝取受體。當CD320功能受損時，LDLR能夠在血液細胞中提供一條替代的B12攝取途徑。這一發(fā)現(xiàn)不僅揭示了維生素B12在不同細胞類型中的攝取機制，還可能為治療因CD320自身抗體引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)B12缺乏提供新的策略。

圖3. LDLR是B12攝取的替代途徑

總結

這篇文章通過創(chuàng)新性地應用Beacon®單細胞光導技術成功鑒定了抗轉鈷胺素受體（CD320）自身抗體，并揭示了這些自身抗體在干擾維生素B12進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的關鍵作用，為自身免疫性維生素B12中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺乏癥（ABCD）的診斷和治療提供了新的生物標志物和治療靶點。此外，全基因組CRISPR篩選技術的應用發(fā)現(xiàn)了LDLR作為B12的替代攝取途徑，這不僅增進了我們對維生素B12在不同細胞中攝取機制的理解，也為相關神經(jīng)退行性疾病的精準治療提供了新的策略和科學依據(jù)。