CHO細胞包括從CHO-ori細胞系衍生出CHO-DXB11 (DHFR+/-) 、CHO-DG44 (-/-) 、CHO-GS、CHO-K1SV等多種細胞系，各具特定的特征，可分離穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染物并獲得高產(chǎn)量。與其他重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)細胞系相比，CHO細胞具有更高的生產(chǎn)力，流加批次培養(yǎng)可達到1-10 g/L。而相較于293細胞，病毒不易感染CHO細胞并在其中復(fù)制。CHO細胞對于蛋白的翻譯后加工修飾與人類細胞的高度相似，如糖基化、二硫鍵形成以及蛋白的水解加工，但是也與人類細胞在翻譯后修飾的特定模式與結(jié)構(gòu)上存在微妙差異，沒有工程化修飾過的CHO細胞不能合成某些人源聚糖鍵，比如：α-2,6-唾液酸化、二分N聚糖和α-1,3/4-巖藻糖基化，為了在CHO細胞內(nèi)實現(xiàn)目的蛋白的糖基化，不同的團隊也開發(fā)了相應(yīng)的糖工程方法。CHO細胞可以進行高密度無血清懸浮培養(yǎng)，并將目的蛋白分泌到培養(yǎng)基中，因而是一個經(jīng)濟有效的大規(guī)模重組蛋白表達平臺。

CHO細胞中重組蛋白的表達可受到多種因素影響，包括：表達質(zhì)粒、啟動子的選擇、培養(yǎng)條件（培養(yǎng)基成分、溫度、溶氧）、CHO細胞系的選擇和表達系統(tǒng)的選擇等。利用CHO細胞進行重組蛋白表達包括瞬時表達和穩(wěn)定表達兩種方式。瞬時表達系統(tǒng)中含有目的基因的cDNA會隨著細胞分裂而被稀釋，表達周期較短。盡管瞬時表達的效率低于穩(wěn)定表達，但優(yōu)化策略后的蛋白產(chǎn)量也可高達1 g/L。而瞬時表達減少了與細胞系開發(fā)相關(guān)的時間和成本，被廣泛用于臨床前研究中蛋白的快速生產(chǎn)。CHO細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)則是大規(guī)模生物制造的標準方法。

蛋白亞單位疫苗是基于病原體的一種或幾種分離或選定的成分，通常是免疫顯性抗原（全蛋白、蛋白結(jié)構(gòu)域或多肽），可在佐劑刺激下使產(chǎn)生體液和/或細胞免疫。蛋白亞單位疫苗因為沒有恢復(fù)到致病形式的風險，也被認為比滅活疫苗或減毒活疫苗更安全。

蛋白亞單位疫苗已被批準用于多種病毒感染性疾病的預(yù)防，如：SARS-CoV-2、水痘-帶狀皰疹病毒、呼吸道合胞病毒和流感，劑量范圍從5到180 ug。盡管新冠的蛋白亞單位疫苗應(yīng)用范圍沒有其他類型疫苗廣，但仍是目前臨床前和臨床候選疫苗的主要選擇。蛋白亞單位疫苗的一個潛在挑戰(zhàn)是免疫原性較低，這也凸顯了識別抗原以引起強大保護性免疫的重要性。

呼吸道合胞病毒是呼吸道感染的主要原因，在幼兒、老年人和慢性病患者中可引起嚴重疾病，2019年幼兒死亡人數(shù)超過100000人，在高收入國家中造成2.2萬到4.7萬人死亡。早期使用甲醛滅活的RSV疫苗，甲醛導(dǎo)致病毒抗原產(chǎn)生羰基集團，阻礙了抗原在細胞質(zhì)中的加工，產(chǎn)生了低親和力的抗體，從而導(dǎo)致了增強型的RSV疾病，表現(xiàn)為：高燒、支氣管炎和呼吸困難。目前RSV表面的病毒融合 (F) 蛋白作為疫苗開發(fā)的潛在靶點，這種預(yù)融合穩(wěn)定形式的設(shè)計已被證明可以產(chǎn)生有效的中和抗體。但也有研究表明，即使采用低劑量預(yù)融合F蛋白在動物上也可能產(chǎn)生增強型RSV疾病。

相比之下，預(yù)融合的F蛋白在成人接種時表現(xiàn)出較好的結(jié)果，也導(dǎo)致葛蘭素史克開發(fā)的RSV疫苗Arexvy疫苗 (RSVPreF3 OA) 的獲批上市。該疫苗使用CHO細胞生產(chǎn)，由F蛋白的1-513號殘基組成，通過T4纖維蛋白結(jié)構(gòu)單元三聚體化。預(yù)融合形式通過將F1的Ser155和Ser290替換為半胱氨酸而實現(xiàn)，在不穩(wěn)定的N端和結(jié)構(gòu)剛性中心區(qū)域之間建立了二硫鍵，另外引入S190F和V207L突變以填充F1N端空隙，增加疏水相互作用。在早期臨床試驗展現(xiàn)良好的安全性，并確認其誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的能力后，和AS01E佐劑一起進入了III期臨床，在17個國家25000名60歲以上成年人中評估有效性。研究結(jié)果顯示，單劑該疫苗對RSV相關(guān)的下呼吸道疾病的有效性為82.6%，對嚴重表現(xiàn)的有效性為94.1%，對RSV相關(guān)急性呼吸道感染的有效性為71.7%。

第二個獲批的RSV疫苗是輝瑞公司的Abrysvo，是由CHO細胞生產(chǎn)的針對RSV A和B亞群的雙價融合前F蛋白。在III期臨床中，對RSV相關(guān)的下呼吸道疾病有66.7%的有效性，對嚴重RSV相關(guān)疾病有85.7%的有效性，且嚴重不良事件發(fā)生率低，安全性無明顯問題。并且也作為孕婦疫苗進行評估，接種孕婦時間為妊娠第24-36周，該疫苗顯示在新生兒出生后的前90天內(nèi)，預(yù)防嚴重RSV相關(guān)呼吸道疾病有81.8%的有效性，因此獲批做為預(yù)防嬰兒RSV的母親疫苗。

以上兩個疫苗受到了市場的廣泛接受，在三個月內(nèi)達到了12.35億美元的銷售額，也凸顯了CHO細胞在疫苗制備中的商業(yè)潛力。

VZV可引起水痘，是一種與典型皮疹和輕微癥狀相關(guān)的高度傳染性感染。初次感染后，病毒可在神經(jīng)元中持續(xù)存在，多年后重新激活會引起帶狀皰疹；重新激活后以皮疼痛性水皰性皮疹為特征，在免疫受損的宿主中可能導(dǎo)致出血性病變，最主要的并發(fā)癥為急性神經(jīng)炎和帶狀皰疹后神經(jīng)痛，影響50歲以上的25%-50%的患者。

為了保護年長或免疫缺陷的成年人，重組VZV疫苗Shingrix于2017年由FDA獲批，一年后獲批EMA。Shringrix是以VZV病毒表面普遍的gE蛋白為抗原，是中和抗體和T細胞識別的關(guān)鍵靶標。該疫苗由CHO細胞生產(chǎn)，并由于去除了C端和跨膜結(jié)構(gòu)域而可以被分泌到細胞外。在抗原產(chǎn)生過程中，CHO細胞的培養(yǎng)條件優(yōu)化后，使用20 L的波浪式反應(yīng)器進行批培養(yǎng)，最終每升產(chǎn)量在2.44 g。在50歲以上人群中，有效性達97.2%以上。

HCMV是一種感染了約80%人口的病原體，一旦個體免疫降低就會引發(fā)健康風險。并且也與各種癌癥進展有關(guān)，其先天性感染也是出生缺陷的主要原因。即便如此，目前也沒有批準上市的疫苗。但有幾款疫苗在臨床試驗中，其中有幾款疫苗基于HCMV表面的gB蛋白由CHO細胞產(chǎn)生，與病毒入侵過程中的膜融合至關(guān)重要，并且包含中和抗體的多個識別表位，該蛋白與佐劑MF59正處于臨床II期進行測試。賽諾菲的gB基因來源于HCMV Towne毒株，不含跨膜結(jié)構(gòu)域和弗林切割位點。gB/MF59疫苗在移植后患者、產(chǎn)后婦女和健康的青春期女孩等不同受眾中均獲得了良好的效果，結(jié)果顯示，gB結(jié)合抗體滴度增加，CD4+T細胞反應(yīng)增強，HCMV病毒血癥降低。

葛蘭素史克的另一款gB蛋白亞單位疫苗處于臨床I期試驗中，抗原基于AD169毒株，其修飾與賽諾菲相似。另外，來自單純皰疹病毒1型的gD氨基酸序列融合在AD169 gB序列以促進分泌。

最近葛蘭素史克開發(fā)的針對HCMV的新型佐劑，由gB蛋白和五聚體抗原組成。HCMV五聚體復(fù)合物也是疫苗開發(fā)中的具有吸引力的抗原，相比于gB蛋白，能誘導(dǎo)更有效的抗體中和進入上皮細胞。因此，葛蘭素史克使用CHO-K1和CHO-DXB11衍生的細胞克隆獲得400 mg/L的五聚體復(fù)合物，并在小鼠中誘導(dǎo)了有效的中和免疫反應(yīng)。五聚體/gB 蛋白亞單位疫苗候選藥物目前正在健康成人受試者中進行評估。

即使在發(fā)現(xiàn)HIV病毒40年后，HIV功能性疫苗的挑戰(zhàn)仍然存在，主要原因包括逆轉(zhuǎn)錄酶中缺乏3’核酸外切酶的校對活性，使得病毒gp41和gp120可快速突變。而中和抗體靶向的抗原表位位于HIV包膜蛋白的gp可變區(qū)域，在免疫系統(tǒng)的篩選壓力下也會導(dǎo)致突變體的產(chǎn)生。

HIV env gp重組三聚體是目前作為疫苗開發(fā)潛力的靶點，可能會引發(fā)廣泛的中和抗體。始終保持融合前構(gòu)象的早期可溶性三聚體稱為“SOSIP”，其中包括gp120-gp41之間的工程化二硫鍵 (SOS) 以及有助于維持融合前構(gòu)象的螺旋斷裂突變（I559P，稱為IP）。最近的臨床試驗中的SOSIP三聚體已經(jīng)進行了改進，包括CHO細胞的改進。其中某些env蛋白，尤其是HIV分支B的env蛋白容易受蛋白水解影響。為了解決這個問題，采用了工程化的C1蛋白酶缺陷的CHO細胞系，從而減少蛋白降解。三聚體4571 (BG505 DS-SOSIP.664) 是基于HIV A分支的高度穩(wěn)定的與融合閉合可溶性包膜糖蛋白三聚體。該三聚體在gp120中結(jié)合了201C-433C二硫鍵突變以防止CD4誘導(dǎo)的構(gòu)象變化。最近三聚體4571在I期臨床試驗中進行了獨立評估，并在異源方案中作為加強劑量中做了評估，結(jié)果顯示三聚體4571是安全的，沒有引起不良反應(yīng)，并能夠成功誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生，主要是集中在三聚體上的無聚糖基底上的抗體。但是對于天然三聚體，通常由于免疫系統(tǒng)無法接觸到無聚糖基底而導(dǎo)致其在臨床試驗中具有更明顯的非中和反應(yīng)。為了減少這種基底定向免疫，未來CHO細胞生產(chǎn)的蛋白亞基疫苗可以使用聚糖進行工程設(shè)計以掩蓋三聚體基底結(jié)構(gòu)域，減少非中和抗體的產(chǎn)生。

SARS-CoV-2蛋白亞單位疫苗開發(fā)廣泛使用的策略之一是使用S蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域 (ECD) 作為抗原。Medigen Vaccine Biologics Corporation開發(fā)的MVC-COV1901疫苗基于融合前穩(wěn)定的S ECD三聚體，該三聚體具有K986P和V987P突變，以及在S1/S2連接處具有弗林蛋白酶切割位點682突變 (RRAR>GGAS) ，以提高穩(wěn)定性并增加了T4纖維蛋白三聚體化結(jié)構(gòu)域。CHO細胞用于生成表達該S抗原的穩(wěn)定克隆，該抗原被證明類似于人HEK293細胞表達的SARS-CoV-2 S蛋白的結(jié)構(gòu)。該候選疫苗用氫氧化鋁（明礬）和CpG 1018佐劑，CpG 1018是一種TLR-9激動劑，通過刺激CD4+/CD8+T淋巴細胞來增強免疫原性。II期臨床試驗 (NCT04695652) 表明，MVC-COV1901是安全的且耐受性良好，并且在年輕人和老年人中都能誘導(dǎo)高中和抗體滴度。MVC-COV1901還與牛津-阿斯利康的ChAdOx1 nCoV-19病毒載體疫苗進行了比較，其中MVC-COV1901被證明，可誘導(dǎo)更廣泛的IgG亞類和更高的抗Omicron (BA.1) 變體的中和抗體滴度。MVC-COV1901已獲準在斯威士蘭、巴拉圭、索馬里蘭和中國臺灣使用。

SARS-CoV-2 S蛋白內(nèi)的受體結(jié)合域 (RBD) 是中和抗體的主要靶點。因此，它已被用于生產(chǎn)各種蛋白亞單位疫苗。已經(jīng)探索了不同的策略來進一步增強其抗原性，例如使用單體、二聚體或多聚體形式。

ZIFIVAX (ZF2001) 疫苗由安徽智飛龍康生物制藥公司開發(fā)，由三劑基于RBD的疫苗和明礬佐劑組成。ZF2001是由兩個拷貝的RBD (R319-K537) 形成并在CHO細胞中產(chǎn)生串聯(lián)重復(fù)的二聚體。這種RBD二聚體與RBD單體保持相似的親和力，而且能夠有效地與人ACE2受體結(jié)合。在I期和II期臨床試驗中，ZF2001在人體中表現(xiàn)出安全特征和免疫原性。在多個國家/地區(qū)進行的III期臨床試驗顯示，在接種疫苗后至少六個月內(nèi)對有癥狀和重度至危重，ZF2001疫苗已獲準在中國、哥倫比亞、印度尼西亞和烏茲別克斯坦使用。

CHO cells for virus-like particle and subunit vaccine manufacturing