細(xì)胞顯微注射---倒置顯微鏡下的深入研究

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>

1.了解顯微操作儀的結(jié)構(gòu)、原理及使用方法。

2.了解細(xì)胞顯微注射的基本原理。

3.掌握細(xì)胞顯微注射的基本技術(shù)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

顯微注射技術(shù)是在倒置顯微鏡下，借助于顯微操作系統(tǒng)將外源的目的基因、特定的分子探針單個精子或細(xì)胞核直接注入到活體靶細(xì)胞中的技術(shù)。是建立試管動物、試管嬰兒、轉(zhuǎn)基因動物等極為重要的技術(shù)方法，同時也為研究動、植物細(xì)胞的發(fā)育和細(xì)胞功能的調(diào)控機(jī)制提供了新的手段。

它的不足之處是：需要昂貴精密的設(shè)備（顯微操作儀），顯微注射操作復(fù)雜，需要業(yè)務(wù)的專業(yè)技術(shù)人員。

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三、實(shí)驗(yàn)用品

1.器具：倒置顯微鏡、顯微操作儀、顯微注射儀、電熱式拉針儀、熔針儀、磨針儀、微型玻璃吸管和玻璃針、細(xì)胞融合儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺、培養(yǎng)皿、蓋玻片。

2.藥品：生理鹽水、PBS緩沖液、乙醇、鹽酸、緩沖培養(yǎng)基（含25mmol/LHEPES,pH7.2）、注射緩沖液[10mmol/LH₂PO^-₄ 和H₂PO^-₄（pH7.2）、84mmol/LK⁺、17mmol/LNa⁺、1mmol/L EDTA]。

3.材料：培養(yǎng)的細(xì)胞、斑馬魚卵或青蛙卵。

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四、實(shí)驗(yàn)方法

㈠材料準(zhǔn)備

1.微注射針頭的拉制

在電熱式拉針儀上裝上一根毛細(xì)管擰緊兩側(cè)的夾子。設(shè)定好電流、拉力和時間后，按開始鍵將毛細(xì)管拉成兩個所需的微注射針頭。

2.蓋玻片的處理

⑴將蓋玻片放在陶瓷或金屬架上，相互不要接觸。

⑵在裝有自來水的燒杯中，快速浸泡和沖洗。

⑶在紙巾上把架子空干，再放入盛有0.1mol/L HCl的燒杯中，溫育過夜。

⑷用自來水沖洗蓋玻片5次，每次10min。

⑸把架子進(jìn)入70%的乙醇中，溫育60min。

⑹用去離子水短暫沖洗，放在紙巾上空干。

⑺在室溫下自然干燥30min.

⑻在220～250℃烤6h.

3.顯微注射用細(xì)胞（受體細(xì)胞）的準(zhǔn)備

⑴倒置顯微鏡：在注射的前一天，將細(xì)胞鋪到直徑為10～15mm的蓋玻片上，每個蓋玻片上250～1000個細(xì)胞。

⑵倒置顯微鏡：在注射前，把帶有需要注射細(xì)胞的蓋玻片轉(zhuǎn)移至新的組織培養(yǎng)皿中，迅速用已經(jīng)滅菌的金剛石筆在蓋玻片上劃一個十字或一個圓圈標(biāo)記，然后加入3ml有緩沖液的培養(yǎng)基。

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㈡顯微注射操作過程

1.注射微細(xì)管針頭定位

⑴倒置顯微鏡：將載有待注射細(xì)胞的蓋玻片轉(zhuǎn)移到里面有緩沖液培養(yǎng)基的平面皿中，將其放在*。

⑵倒置顯微鏡：將培養(yǎng)皿放在顯微鏡的載物臺上，盡量將蓋玻片上所畫圓圈的一個對準(zhǔn)光照的中心區(qū)。

⑶倒置顯微鏡：用低倍鏡對準(zhǔn)細(xì)胞調(diào)焦。

⑷倒置顯微鏡：將針頭推入視野中心，在視野中針頭誠陰影狀。

⑸倒置顯微鏡：輕輕落下針頭，直到培養(yǎng)基中后停下。

⑹倒置顯微鏡：通過顯微鏡觀察，移動針頭，直到針頭陰影在視野的上方，然后確定針頭的位置，使其處在視野的中心。

⑺倒置顯微鏡：輕輕下調(diào)針頭，直到針頭變的清晰一些。

⑻倒置顯微鏡：調(diào)至工作放大倍數(shù)，調(diào)準(zhǔn)焦距，找到針尖。

⑼倒置顯微鏡：小心下調(diào)針尖，直到其*聚焦清晰。

2.顯微注射操作

⑴用注射微細(xì)管吸取注射樣品。

⑵用握持微細(xì)管吸附并固定住受體細(xì)胞。

⑶調(diào)整注射微細(xì)管針尖位置，使針尖對準(zhǔn)受體細(xì)胞。

⑷移動注射微細(xì)管針尖，使其進(jìn)入受體細(xì)胞。

⑸使用顯微注射儀施加注射壓，將注射樣品注入受體細(xì)胞。

⑹輕輕上提注射微細(xì)管，直到離開已注射細(xì)胞。

⑺移動顯微鏡載物臺，找到下一個細(xì)胞，重復(fù)1～6步驟。

五、注意事項(xiàng)

1.顯微操作儀屬于精密儀器，在使用時一定要嚴(yán)格按照操作流程進(jìn)行，以免損壞儀器。

2.注射速度過快將擾亂細(xì)胞質(zhì)成分，造成細(xì)胞破裂后細(xì)胞移位。

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