圖3. PBT/NO/Pt在水溶液中的表征

鑒于 PNC11BA 出色的 1064 nm 消光系數(shù)和 PNC11BA NPs 明亮的 NIR-II 熒光，研究者利用它們制備光療劑。PNC11BA 側(cè)鏈上的 PBA 基團很容易通過供體-受體配位負(fù)載順鉑 (CDDP) 和 NO 供體(DETA NONOate)。如圖 3a 所示，通過常規(guī)沉淀實現(xiàn)了 PNC11BA、CDDP、DETA NONOate、DMPC 和DSPE-PEG2000-cRGD 的自組裝，得到了多功能光療納米粒子 (稱為 PBT/NO/Pt)。CDDP 被負(fù)載在這些納米粒子上作為化療藥物和 NOX 活性 O2•?發(fā)生器。DETA NONOate 被選為 pH 響應(yīng)的 NO 供體。制備了僅負(fù)載DETA NONOate 或 CDDP 或不負(fù)載 DETA NONOate 和 CDDP 的 PNC11BA NPs 作為對照（表示為 PBT/NO、PBT/Pt 和 PBT）。動態(tài)光散射 (DLS) 表明 PBT/NO/Pt 的流體動力學(xué)直徑 (Dh) 為 66.64 nm，PDI低至 0.176（圖 3b）。所得 PBT/NO/Pt 具有球形納米顆粒，通過透射電子顯微鏡 (TEM) 測量其直徑為 80 nm（圖 3c）。能量色散 X 射線元素映射 (EDS) 顯示 Pt 元素在納米粒子中分布良好，表明 CDDP 負(fù)載成功（圖 3d）。根據(jù)微孔板讀數(shù)儀和電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）獲得的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出DETA NONOate 和 CDDP 在 PBT/NO/Pt 中的負(fù)載效率分別為 5.42% 和 3.18%。

如圖 3e 所示，水溶液中的 PBT/NO/Pt 在 800-1350 nm 處表現(xiàn)出強烈的 NIR 吸收，在 1064 nm 處的消光系數(shù)為 1.195 L g-1 cm-1。在水溶液中 808 nm 光激發(fā)下，PBT/NO/Pt 顯示出強烈的 NIR-II 熒光，中心位于 1101 nm，長尾延伸至 1350 nm（圖 3f）。NIR-II FL 強度在 60 分鐘內(nèi)幾乎保持恒定（808 nm，0.5 W cm-2），表明 PBT/NO/Pt 具有光穩(wěn)定性。圖 3g 顯示了不同濃度下 PBT/NO/Pt 的 NIR-II PA 圖像。NIR-II PA 信號與 NPs 濃度表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系（圖 3h）。在 1064 nm 激光輻照（1.0 W cm?2）下驗證了 PBT/NO/Pt 的光熱性能。如圖 3i 所示，水溶液的溫度隨 PBT/NO/Pt 濃度的增加而升高。例如，在 0.1 mg mL?1 PBT/NO/Pt 下，溫度在 6 分鐘內(nèi)升高到 53 °C，PCE 計算為53.65%。此外，還忠實證明了 PBT/NO/Pt 在光熱作用下的穩(wěn)定性，在五次光開/關(guān)照射循環(huán)中，PBT/NO/Pt 溶液的溫度變化小于 2 °C（圖 3j）。

接下來探索了 PBT/NO/Pt 中 DETA NONOate 和 CDDP 的酸響應(yīng)釋放曲線。使用典型的 Griess 測定法來量化 pH 7.4 和 pH 5.5 水溶液中 DETA NONOate 的釋放。如圖 3k 所示，在 pH 7.4 下，90 分鐘后PBT/NO/Pt 中 NO 的生成量最小。相反，在 pH 5.5 下，90 分鐘后 NO 釋放量超過 60 µm，反映了 DETA NONOate 和 PBA 基團之間供體-受體配位相互作用在酸反應(yīng)下解離以及 DETA NONOate 降解。在酸反應(yīng)下從 PBT/NO/Pt 中釋放 CDDP 是此設(shè)計中的關(guān)鍵步驟，因為 CDDP 只能在弱酸性細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中激活 NOX 產(chǎn)生 O2•?。通過 ICP-OES 評估了 PBT/NO/Pt 中 CDDP 的釋放情況（圖 3l），結(jié)果表明 pH 值為 7.4 時，90 分鐘后 CDDP 釋放量可忽略不計，而 pH 值為 5.5 時，由于氨基和 PBA 基團的加速解離，CDDP 釋放量超過 60%。這些結(jié)果表明，PBT/NO/Pt 中不利的 DETA NONOate 和 CDDP 泄漏在血液循環(huán)過程中可能受到限制，從而支持 NO 和 CDDP 在酸性腫瘤組織和癌細(xì)胞中的靶向釋放。

圖4. 細(xì)胞內(nèi)生成 NO、O2•? 和 ONOO?

圖 4a 顯示了細(xì)胞內(nèi) NO、O2•?和 ONOO?的產(chǎn)生方式。首先通過共聚焦激光掃描顯微鏡 (CLSM) 和流式細(xì)胞術(shù)檢查 PBT/NO/Pt 的細(xì)胞攝取情況。與載有 FITC 染料的 PBT/NO/Pt 孵育 1.5 小時后，在 SKOV3/DDP 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)大量綠色熒光。孵育時間延長至 3 小時后觀察到更強的綠色熒光，表明 PBT/NO/Pt 進入細(xì)胞（圖 4b）。鑒于已證實酸觸發(fā)的 NO 生成和 CDDP 釋放，隨后監(jiān)測細(xì)胞內(nèi) NO、O2•?和原位 ONOO?形成。使用商用 NO 熒光探針(DAF-FM DA) 評估細(xì)胞內(nèi) NO 水平。如圖 4c 所示，SKOV3/DDP 細(xì)胞與 PBT/NO/Pt 和 PBT/NO 孵育 3 小時后，由于DETA NONOate 在酸的作用下分解，觀察到更強的綠色熒光。相比之下，PBT/Pt 和 PBT 處理的 SKOV3/DDP 細(xì)胞和對照表現(xiàn)出非常弱的熒光，表明這些納米顆粒沒有產(chǎn)生 NO。CDDP 在酸性細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中釋放，然后催化 NOX s產(chǎn)生 O2?。作者使用O2•?探針二氫乙錠 (DHE) 監(jiān)測了 SKOV3/DDP 細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi) O2•?水平。如圖 4d 所示，在PBT/NO/Pt 和 PBT/Pt 處理的SKOV3/DDP 細(xì)胞中觀察到明顯的紅色熒光 (O2•?)，表明細(xì)胞內(nèi) O2•?生成效率高。然而，由于缺乏 CDDP，在 PBT/NO 和 PBT 處理的SKOV3/DDP 細(xì)胞和對照中未檢測到紅色熒光。NO 和 O2•?結(jié)合產(chǎn)生 ONOO?，因此，使用商業(yè)探針 BBoxiProbe O71 測量細(xì)胞內(nèi) ONOO?。如圖 4e 所示，與 PBT/NO 和PBT/Pt 一起孵育的 SKOV3/DDP 細(xì)胞分別由于缺乏 O2•?和 NO 而未顯示出明顯的綠色熒光。正如預(yù)期的那樣，在與 PBT/NO/Pt 一起孵育的 SKOV3/DDP 細(xì)胞中觀察到了綠色熒光，表明通過原位產(chǎn)生 NO 和 O2•?產(chǎn)生了豐富的 ONOO?。通過流式細(xì)胞分析進一步定量統(tǒng)計研究了PBT、PBT/NO/Pt、PBT/NO和PBT/NO/Pt處理的SKOV3/DDP細(xì)胞內(nèi)NO、O2•?和ONOO?的生成情況（圖4f，g），這與上述CLSM成像結(jié)果一致。

圖5. 體外評價PBT/NO/Pt在SKOV3/DDP細(xì)胞中的抗癌活性及機制

PBT/NO/Pt 引發(fā)癌細(xì)胞中 NO、O2•?和 ONOO?的形成。通過甲基噻唑基四唑 (MTT) 測定法測試了 PBT/NO/Pt 在 SKOV3/DDP 細(xì)胞中的抗癌作用。如圖 5a 所示，PBT 處理組的細(xì)胞存活率略有下降。相反，在 100 µg mL?1下，PBT/Pt、PBT/NO 和 PBT + 激光處理的 SKOV3/DDP 細(xì)胞中的存活率分別下降至 79.1%、64.3% 和 49.8%。在所有組中，1064 nm 激光（6 分鐘，1.0 W cm?2）處理的 PBT/NO/Pt 組表現(xiàn)出抑制作用（細(xì)胞存活率下降至 13.38%），證明了 PBT/NO/Pt 中 NIR-II PTT 和 ONOO?的優(yōu)異協(xié)同作用。還通過流式細(xì)胞術(shù)分析了 PBT/NO/Pt 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和壞死（圖 5b），結(jié)果表明 PBT/NO/Pt + 激光組的細(xì)胞毒性，高凋亡率，約為 87%。相反，PBT/NO、PBT/Pt 和 PBT + 激光僅誘導(dǎo)中等程度的細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明 PBT/NO/Pt 通過共遞送 NO 和 CDDP 以及原位生成ONOO?在 SKOV3/DDP 細(xì)胞中具有有效的抗癌活性（圖 5e）。

為了直觀地了解 PBT/NO/Pt 的治療效果，通過 JC-1 染色評估了線粒體損傷。共聚焦成像和定量分析顯示，PBT/NO/Pt + 激光治療組出現(xiàn)了最亮的綠色熒光，表明線粒體膜電位喪失；流式細(xì)胞術(shù)也獲得了類似的結(jié)果（圖 5c、f）。PBT/NO/Pt + 激光組的細(xì)胞內(nèi) ATP 水平下降（約 30%），可能是由于線粒體功能受到抑制（圖 5h）。使用 γ-H2AX（DNA 雙鏈斷裂的常規(guī)標(biāo)記物）評估 PBT/NO/Pt 造成的 DNA 損傷程度。在 PBT/NO/Pt + 激光細(xì)胞中觀察到最亮的綠色熒光，表明 CDDP-DNA 加合物有效形成，ONOO?造成的 DNA 損傷更嚴(yán)重（圖 5d、g）。隨后，在SKOV3/DDP細(xì)胞中探究了PBT/NO/Pt的治療機制。早先有報道稱，CDDP可以形成Pt-GSH復(fù)合物并減少CDDP-DNA加合物的生成，從而誘導(dǎo)CDDP的解毒。用ThioTracker Violet測量了PBT/NO/Pt形成ONOO?對SKOV3/DDP細(xì)胞內(nèi)GSH的影響。在圖5i中，在空白對照和PBT、PBT/NO和PBT/Pt處理的SKOV3/DDP細(xì)胞中觀察到明亮的綠色熒光。相比之下，PBT/NO/Pt+激光處理的SKOV3/DDP細(xì)胞顯示出明顯較少的綠色熒光，表明GSH含量損失。流式細(xì)胞術(shù)和定量分析也得到了類似的結(jié)果，表明PBT/NO/Pt+激光降低了細(xì)胞內(nèi)GSH（圖5j）。因此，ONOO?下調(diào)細(xì)胞內(nèi) GSH，從而改善 CDDP 與靶DNA 的結(jié)合并促進癌細(xì)胞凋亡。

通過蛋白質(zhì)印跡法研究了相關(guān)蛋白（Pro-caspase-3、Bcl-2、γ-H2AX和 GS）的表達（圖 5k、l、m）。在用 PBT/NO/Pt 和 1064 nm 光處理的 SKOV3/DDP 細(xì)胞中，裂解的 caspase-3 表達顯著誘導(dǎo)，Bcl-2 下調(diào)，表明更多細(xì)胞開始凋亡（圖 5k、l）。正如預(yù)期的那樣，γ-H2AX和 GS 的表達與之前的結(jié)果一致，解釋了為什么PBT/NO/Pt + 激光照射會造成更嚴(yán)重的 DNA 損傷。這些結(jié)果證實，原位 ONOO?生成下調(diào)了細(xì)胞內(nèi) GSH，增加了 CDDP–DNA 加合物和裂解的 caspase-3 的水平，從而促進了細(xì)胞凋亡。

圖6. SKOV3/DDP 荷瘤小鼠體內(nèi) NIR-II FL、NIR-II PA 和光熱成像

研究了 PBT/NO/Pt 的體內(nèi)抗癌效率。在體內(nèi)實驗之前，通過 NIR-II FL 和 NIR-II PA 成像系統(tǒng)可視化了腫瘤部位的 PBT/NO/Pt 積累。SKOV3/DDP 腫瘤異種移植小鼠接受靜脈注射 PBT/NO/Pt（150 µL，2.0 mg mL?1），并在注射后 0.1、6、12、24 和 36 小時獲取圖像。如圖 6a、c 所示，腫瘤部位的 NIR-II FL 和 NIR-II PA 信號在 6 小時時變亮，并在 24 小時達峰值。通過上述實驗得出結(jié)論，NIR-II FL 和 NIR-II PA 成像可以為 1064 nm 激光治療提供精確指導(dǎo)。圖 6b、d 顯示了腫瘤部位的定量成像分析，其中 NIR-II FL 和 NIR-II PA 中的成像強度分別比注射前高 7.3 倍和 9.4 倍，表明 PBT/NO/Pt 通過增強滲透性和保留 (EPR) 效應(yīng)在腫瘤部位積累。注射后 24 小時，獲得了腫瘤和主要器官的 NIR-II FL 和 NIR-II PA 圖像。離體數(shù)據(jù)顯示，腫瘤部位積累的 PBT/NO/Pt 比其他組織（包括代謝器官）更多。此外，在注射 PBT/NO/Pt 后 24 小時對腫瘤部位進行了典型的體內(nèi)光熱成像（圖 6e、f）。1064 nm 激光照射（1.0 W cm?2）后腫瘤溫度逐漸升高，并在約 6 分鐘時達到峰值 53 °C。在用 PBS 治療的腫瘤小鼠中，沒有檢測到明顯的體溫升高。

圖7. 對SKOV3和SKOV3/DDP腫瘤小鼠的體內(nèi)腫瘤抑制作用

在兩種皮下腫瘤模型（SKOV3 和 SKOV3/DDP 異種移植裸鼠）中評估了 PBT/NO/Pt 的體內(nèi)癌癥抑制作用。荷瘤小鼠隨機分為六組：（I）對照組、（II）PBT、（III）PBT/Pt、（IV）PBT/NO、（V）PBT + 激光和（VI）PBT/NO/Pt + 激光。靜脈注射 PBS、PBT、PBT/Pt、PBT/NO 或 PBT/NO/Pt（150 µL，2.0 mg mL?1）后，每 2 天監(jiān)測一次腫瘤大小。注射后 24 小時，PBT + 激光和 PBT/NO/Pt + 激光組的腫瘤部位暴露于 1064 nm 激光（1.0 W cm?2）照射 6 分鐘。如圖7a所示，15 天后，與對照組（腫瘤體積增加 10.2 倍）相比，PBT/Pt 表現(xiàn)出非常弱的抗癌效果（腫瘤體積增加 7.4 倍）。PBT/NO 和 PBT + 激光組的腫瘤體積分別增加了 7.0 倍和 5.2 倍，表明單一 NO 氣體和 NIR-II PTT 療法比 PBT/Pt 提供更好的腫瘤生長抑制效果。與此形成鮮明對比的是，由于 Pt、NO 和 NIR-II PTT 以及ONOO?爆發(fā)的協(xié)同作用，PBT/NO/Pt + 激光產(chǎn)生了腫瘤抑制能力。15 天后，從每組中切除腫瘤并成像（圖 7b）。還記錄了收集的腫瘤的重量和體積。對照組、PBT組、PBT/Pt組、PBT/NO組、PBT+激光組和PBT/NO/Pt+激光組的平均腫瘤重量分別為1.16、1.12、0.89、0.80、0.60和0.10 g，證明了1064 nm激光照射后PBT/NO/Pt具有顯著的抑癌活性（圖7c）。圖7d-f說明了PBT/NO/Pt+激光對SKOV3/DDP荷瘤小鼠的突出癌癥抑制作用。進一步檢測到第15天分離的SKOV3腫瘤中凋亡相關(guān)蛋白（Pro-caspase-3、Bcl-2、γ-H2AX和GS）的表達（圖7g、h、i）。與之前的結(jié)果一致，PBT/NO/Pt+激光下調(diào)了GSH，導(dǎo)致更嚴(yán)重的DNA損傷，并抑制了腫瘤的生長。

為了探索 PBT/NO/Pt 的腫瘤抑制能力，通過蘇木精-伊紅 (H&E) 染色、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 dUTP 缺口末端標(biāo)記 (TUNEL) 染色、免疫組織化學(xué) (Ki-67 抗體染色) 和 γ-H2AX 免疫熒光染色分析了組織切片。如圖 7j 所示，PBT/NO/Pt + 激光誘導(dǎo)凋亡反應(yīng)、腫瘤抑制和 DNA 損傷，驗證了 PBT/NO/Pt 的放大治療效果。這些結(jié)果表明，PBT/NO/Pt 共同遞送的 CDDP 和 DETA NONOate 通過產(chǎn)生 ONOO? 以及 Pt、NO 和 NIR-II PTT 的協(xié)同作用導(dǎo)致 DNA 損傷和細(xì)胞凋亡。

在這項工作中，開發(fā)了一個光療平臺 PBT/NO/Pt，并展示了臨床應(yīng)用潛力的幾個優(yōu)勢。共軛聚合物 PNC11BA 具有內(nèi)在的生物相容性，可以通過合理設(shè)計聚合物主鏈實現(xiàn)生物降解性。PBT/NO/Pt 對腫瘤微環(huán)境中表達的酸性和高 NOX 表現(xiàn)出優(yōu)異的選擇性和敏感性，有利于消除具有多藥耐藥性的癌癥。 PBT/NO/Pt具有優(yōu)異的光穩(wěn)定性和膠體穩(wěn)定性。

本文構(gòu)建了一種 NIR-II 光觸發(fā)多功能 ONOO? 納米發(fā)生器 (PBT/NO/Pt)，用于在 NIR-II FL/NIR-II PA 成像引導(dǎo)下進行協(xié)同 NIR-II PTT/化療/過氧亞硝酸鹽治療。PBT/NO/Pt 在 1064 nm 激光輻照下表現(xiàn)出強 NIR-II 吸收、優(yōu)異的 NIR-II 熒光發(fā)射、強烈的 NIR-II PA 信號和優(yōu)異的 PCE (η = 53.65%)。此外，PBT/NO/Pt 到達腫瘤部位，腫瘤微環(huán)境中的酸性和高濃度 NOX 使 NO 和 O2•? 同時釋放，隨后原位形成 ONOO?。這種原位生成 ONOO? 通過下調(diào)細(xì)胞內(nèi) GSH 和增加 DNA 損傷對SKOV3/DDP 細(xì)胞具有顯著的抗癌作用。體外和體內(nèi)研究表明，在 ONOO? 和化療增強的 NIR-II PTT 下，PBT/NO/Pt 具有顯著的抗 SKOV3 和 SKOV3/DDP 腫瘤抑制作用。因此，開發(fā)的 NIR-II 光激發(fā)多功能 ONOO?納米發(fā)生器是治療耐藥性腫瘤的一種有前途的策略。

參考文獻

Sun P, Hu D, Chen P, et al. Anti‐Quenching NIR‐II Excitation Phenylboronic Acid Modified Conjugated Polyelectrolyte for Intracellular Peroxynitrite‐Enhanced Chemo–Photothermal Therapy[J]. Advanced Science, 2024: 2309446.